一氧化氮合酶与基质金属蛋白酶-9在孕妇胎膜早破中的表达

一氧化氮合酶与基质金属蛋白酶-9在孕妇胎膜早破中的表达

王占辉

(青岛市胶州中心医院产科, 山东 青岛 266300)

【摘要】目的探讨一氧化氮合酶(iNOS)与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在胎膜早破中的表达及其临床意义。方法入选在我院进行规律产检的90例中足月胎膜早破者30例(tPROM组)，早产胎膜早破者30例(pPROM组)，正常足月妊娠并进行剖宫产终止妊娠者30例(对照组)。分别采用免疫组织化学染色和ELISA法检测胎膜、血清及羊水中iNOS和MMP-9的表达，并通过HE染色检测是否患有绒毛膜羊膜炎。结果iNOS在pPROM组胎膜中的表达高于tPROM组(P<0.01)和对照组(P<0.01),在tPROM和对照组中表达无显著差异(P>0.05)。MMP-9在PROM组胎膜、血清及羊水中的表达均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。结论iNOS和MMP-9的表达水平与PROM的发生密切相关，且iNOS和MMP-9的表达相互关联。

【关键词】基质金属蛋白酶; 一氧化氮合酶; 早产胎膜早破; 足月胎膜早破

【中图分类号】R 714.15+1【文献标志码】A

收稿日期：( 2014-01-07； 编辑： 张文秀)

The clinical significance of inducible nitric oxide synthase and matrix metalloproteinases-9 in patients with premature rupture of membranesWANG Zhanhui

(DepartmentofObstetrics,JiaozhouCentralHospitalofQingdao,Qingdao266300,Shandong,China)

Abstract【】ObjectiveTo explore the clinical significance of matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) and inducible nitric oxide synthase(iNOS) in patients with premature rupture of membranes and the relationship between MMP-9 and iNOS. Methods60 pregnant women underwent PROM and 30 women delivered by cesarean section before labor were divided into three groups due to their state: the term premature rupture of the membranes group (tPROM), the preterm premature rupture of the membranes group(pPROM), and the control group who had cesarean section without PROM. Immuno histochemical method was used to detect the expression level of MMP-9 and iNOS in fetal membranes. The level of MMP-9 in serum and amniotic fluid was detected by ELLSA. ResultsThe expression level of iNOS in fetal membranes in pPROM group was higher than that expressed in tPROM group(P<0.01) and control group(P<0.01). A statistically significant difference of the expression of MMP-9 was also found in fetal membranes(P<0.01), serum(P<0.01) and amniotic fluid(P<0.01) in PROM group than in control group. ConclusionThe expression level of iNOS and MMP-9 has close relationship with PROM.

【Key words】Matrix metalloproteinase-9; Nitric oxide synthase; Preterm premature rupture; Term preterm rupture

胎膜早破(premature rupture of membranes，PROM)是指孕妇在临产前胎膜发生破裂，根据发生时间不同，会对母儿造成不同程度的危害。若在妊娠满37周后出现称为足月胎膜早破(premature rupture of membranes of term，tPROM)，在28周到37周出现称为早产胎膜早破(preterm premature rupture of membranes，pPROM)[1]。统计发现，PROM在足月妊娠和早产中的发生比例分别为10%和3.5%[2]。胎膜早破是引起早产、围生期胎儿死亡的常见原因之一，国内外研究人员虽对其发病原因和发病机制进行了大量研究，提出多种观点(如代谢失衡)[3]，但其确切病因及病理目前尚未完全明确。一氧化氮合酶(iNOS)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)被认为是与调节病理部位代谢密切相关的两个因素，目前对其在癌变[4-5]、感染[6]部位的变化及作用机理研究较多，但是鲜有关于iNOS、MMP-9与PROM关系的报道。了解iNOS、MMP-9和PROM的关系对PROM的预防、诊断和治疗具有重要意义。本研究旨在通过检测MMP-9和诱导型iNOS在早产、足月胎膜早破组和正常足月妊娠组的胎膜组织中的表达，探讨其与PROM发病的关系，现报告如下。

1资料与方法

1.1研究对象选取于2012年6月1日到2013年9月30日在我院进行规律产检，并于28周以后发生胎膜早破的病例60例，其中足月胎膜早破者30例(tPROM组)，早产胎膜早破者30例(pPROM组)，选取正常足月妊娠并进行剖宫产终止妊娠者30例作为对照组。三组孕妇年龄在23～35岁之间，平均(27.93±5.48)岁，使用SPSS进行统计学分析后发现各组孕妇的年龄和孕产次均无显著差异(P>0.05)。

1.2仪器与试剂仪器：离心机(Thermo)，酶标仪(Thermo)，石蜡包埋机(Leica)，石蜡切片机(Leica)。试剂：苏木素伊红染色试剂盒，iNOS兔抗人多克隆抗体，二步法抗兔、鼠通用型免疫组化检测试剂盒，人基质金属蛋白酶-9定量ELISA试剂盒等，以上试剂均购自北京中杉生物技术公司

1.3诊断标准分别根据孕妇最后一次月经时间准确计算孕周。PROM诊断标准参照人卫版教材《妇产科学》第七版。

1.4实验方法与步骤

1.4.1取样方法 在进行剖宫产手术前，首先对所有病例进行常规静脉取血3ml，术中抽取羊水3ml，置于-4℃冰箱过夜保存，离心，取上清，置于-20℃冰箱中保存待用。胎盘娩出后取近破口处的胎膜，用PBS冲洗3次，去掉蜕膜组织和血迹。将取出的样品分为两份，分别用于HE染色和免疫组化染色。

1.4.2切片与染色①石蜡切片：将样品做好标记后分别进行常规4%多聚甲醛固定，24～48h后依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片。②经常规脱蜡、水化后一部分进行HE染色，镜检。③按照试剂盒说明分别对切片进行iNOS、MMP-9免疫组化染色。首先将剩余样片用血清进行封闭，分别加一抗4℃孵育过夜，后加二抗室温孵育1h。最后进行封片，镜检。④用ELISA法检测血清和羊水中iNOS和MMP-9的含量：从冰箱中取出样品，室温溶解后，配制标准品，然后加样，经过孵育、洗涤、显色、终止后，于酶标仪上450nm波长下进行吸光度(OD值)测定。⑤HE染色镜检每个视野中中性粒细胞浸润情况，每个高倍镜视野中大于11个则判断患有绒毛膜羊膜炎。参照Fromwitz综合记分法对免疫组化镜检照片进行半定量分析，并根据阳性细胞百分率及显色深浅评分，评分标准见表1。

1.5统计学分析 对实验中得出的数据，使用SPSS软件对计数资料进行t检验分析，对等级资料进行秩和检验分析，相关性分析用Spearman等级相关分析,当P<0.05为差异有统计学意义。

表1　MMP-9和iNOS在胎膜组织中表达评分标准

2结果

2.1HE染色观察通过观察胎膜石蜡切片HE染色结果，胎膜早破患者中，感染者23人，未感染者37人；对照组中，感染者6人，未感染者24人。两组比较无统计学意义(χ2=3.078,P=0.079)。

2.2iNOS在胎膜中的表达iNOS在pPROM组胎膜中的表达水平高于对照组，差异极显著(P<0.01)，见表2；iNOS在tPROM组胎膜中的表达与对照组相比，差异不显著(P>0.05)，见表3。

表2　iNOS在pPROM和对照组胎膜中的表达

表3　iNOS在tPROM和对照组胎膜中的表达

2.3MMP-9在胎膜和血清及羊水中的表达

2.3.1MMP-9在胎膜组织中的表达MMP-9在pPROM组胎膜中的表达高于对照组，差异极显著(P<0.01)，见表4；其在tPROM组中的表达也高于对照组，差异显著(P<0.05)，见表5；MMP-9在pPROM组和tPROM组中表达无显著差异(P>0.05)。

2.3.2MMP-9在血清及羊水中的表达MMP-9在pPROM组血清和羊水中的表达高于对照组，差异极显著(P<0.01)；其在tPROM组血清和羊水的表达也高于对照组，差异极显著(P<0.01)；MMP-9在tPROM组血清中的表达高于pPROM组，表达差异显著(P<0.05)，在羊水中差异极显著(P<0.01)，见表6。

表4　MMP-9在pPROM和对照组胎膜中的表达

表5　MMP-9在tPROM和对照组胎膜中的表达

表6　MMP-9在血清及羊水中的表达

注：血清中pPROM组较对照组t=27.72，P=0.00；tPROM组与对照组比较t=26.24，P=0.00；pPROM组与tPROM组比较t=5.04，P=0.02；羊水中pPROM组较对照组t=0.48，P=0.00；tPROM组与对照组比较t=7.38，P=0.00；pPROM组与tPROM组比较t=0.60，P=0.00

2.4胎膜中iNOS和MMP-9的相关性分析iNOS和MMP-9在胎膜中的表达符合正相关(P<0.01)，见表7。

表7　iNOS和MMP-9的相关性

注：r=0.560；P=0.000

3讨论

胎膜是一个无血管，无神经的实体，通过羊水维持其稳定性[7]，从而为胎儿提供一个稳定的发育环境。而胎膜的完整性与胶原蛋白的分泌和代谢密切相关[8]。微生物感染[9]、营养状况不佳[10，11]、外伤、胎膜发育不良等状况均会造成胶原的代谢失衡，从而引起胎膜早破。iNOS主要位于噬中性粒细胞、巨噬细胞，正常情况下不表达。iNOS在病理部位过量表达，引起异常部位NO浓度过高，参与体内免疫调节过程。而外源刺激持续存在，NO持续升高会导致炎症级联瀑布反应，进一步推动炎症反应的发展[12]。当胎膜早破发生iNOS表达过量的NO，NO作为一种信号分子，参与抗菌，抗病毒[13]，由此进一步保护胎儿正常发育。

本实验结果表明，iNOS在pPROM中的表达显著高于tPROM组和对照组，由此推断iNOS在pPROM发病中起重要作用；由tPROM组和对照组差异不显著，推断iNOS在tPROM的发病中不起重要作用，且pPROM和tPROM的发病机理可能并不相同。基质金属蛋白酶(MMPs)是Zn2+依赖型的肽链内切酶，可降解多种细胞外基质蛋白，并且受多种生理和病理过程的调控。MMP-9可降解胎膜中的胶原，而胶原又是决定胎膜机械性能的主要成分[2]，所以MMP-9在研究PROM发病机理中至关重要。此外MMP-9可激活包括CXCL5、CXCL6、CXCL8在内的多种趋化因子配体，并可促进释放细胞表面受体(如，肿瘤坏死因子-α受体)从而改变局部微环境[14]。MMP-9有多个炎症相应元件，尤其是蛋白-1和NF-κB位点使其对炎症刺激敏感[15]。本研究显示MMP-9在pPROM和tPROM组的羊水和血清中的表达量均高于对照组，差异显著；且其在pPROM和tPROM中的表达差异不显著。MMP-9在三组胎膜中的免疫組化染色结果和羊水及血清中的结果相吻合，所以推断组织中MMP-9的正常表达对维持胎膜完整性方面具有一定影响。这与前人的研究结果是一致的[16-17]。使用NO抑制剂会影响MMP-9基因的表达而抑制MMP-9的产生，从而影响胚胎着床。本实验验证了iNOS和MMP-9的分泌水平与PROM的发生存在关联。研究表明NO与过氧化物阴离子反应产生的过氧硝酸根是调节助氧化剂和NO毒性作用的关键[18]。NO可能是通过生成过氧硝酸根来间接激活MMP-9前体[19]，从而产生大量MMP-9降解胎膜中包括胶原在内的细胞外基质蛋白，造成胎膜早破。

4结论

iNOS和MMP-9的表达水平与PROM的发生密切相关，且iNOS和MMP-9的表达相互关联，前者能够刺激后者的表达。同时，也可根据iNOS对MMP-9的关联作用，使用iNOS抑制剂，间接调控MMP-9的生成，以减少PROM的发生。

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