牛蒡苷通过激活p38 MAPK抑制舌癌Tca8113细胞增殖的实验研究

牛蒡苷通过激活p38 MAPK抑制舌癌Tca8113细胞增殖的实验研究*

于四海严晓峰

(重庆市公共卫生医疗救治中心口腔科， 重庆 400036)

【摘要】目的探讨牛蒡子苷对于人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖的调节作用及相关的分子机制。方法将Tca8113细胞分为对照组(Control组)、牛蒡苷干预组(ATG干预组)及牛蒡苷+p38 MAPK抑制剂SB203580组(ATG+SB组)3组。使用MTT法对不同时间点(0 h，24h和72h)各组Tca8113细胞活性进行检测；使用western blot法对干预24小时后Tca8113细胞的p38 MAPK的活化水平及caspase-3的活化水平进行分析。结果与对照组相比，给予牛蒡苷干预的Tca8113细胞活性呈时间依赖性下降，差异均有统计学意义(P均<0.05)，且各时间点ATG组较ATG+SB组细胞活性下降程度更加明显，差异均有统计学意义(P均<0.05)。干预24小时后，给予牛蒡苷干预的Tca8113细胞p38 MAPK及caspase-3的活化水平均有显著的上升，差异有统计学意义(P均<0.05)；但ATG组较ATG+SB组细胞p38 MAPK及caspase-3的活化水平上升更加明显，差异有统计学意义(P均<0.05)。结论牛蒡苷可以通过激活p38 MAPK促进人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞caspase-3的活化，从而抑制Tca8113细胞的增殖。本实验为牛蒡子苷应用于舌癌和其他肿瘤的临床治疗奠定了一定的基础。

【关键词】Tca8113细胞； 牛蒡子苷； P38 MAPK； Caspase-3

【中图分类号】R 329.2+8【文献标志码】A

基金项目：国家“十二五”科技重大专项课题(2012zx10005-008)

通讯作者：严晓峰，E-mail：yanxiaofeng2015@tom.com

收稿日期：( 2014-09-11； 编辑： 张文秀)

Arctigenin inhibits the proliferation of tongue cancer Tca8113 cells by activation of p38 MAPKYU Sihai, YANG Xiaofeng

(DepartmentofStomatology,ChongqingPublicHealthMedicalCenter,Chongqing400036,China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of arctigenin on the proliferation of tongue cancer Tca8113 cells and its potential mechanism. MethodsTca8113 cells were divided into 3 groups including control group, arctigenin (ATG) group and arctigenin+SB203580 group (ATG+SB) group. MTT was used to analyze the cell viabilities of Tca8113 cells in different time points at 0h, 24h and 72h. 24 hours after interventions, the activation of p38 MAPK and caspase-3 were measured by Western blot.ResultsThe cell viabilities of Tca8113 cells were time-dependently reduced by ATG treatment. However, SB203580 blunted this effect of ATG. 24 hours after intervention, the activation of p38 MAPK and caspase-3 were noticeably increased by ATG. Meanwhile, we also found that these effects of ATG were largely abrogated by SB203580. ConclusionThe proliferation were inhibited by arctigenin (ATG) through activation of p38 MAPK/caspase-3 pathway in tongue cancer Tca8113 cells.

【Key words】Tca8113 cells; Arctigenin; P38 MAPK; Caspase-3

舌癌是口腔恶性肿瘤中最常见的类型，同时流行病学研究发现由于人口老龄化和饮食结构的改变舌癌等口腔癌的发病率呈逐年上升趋势，且有年轻化的倾向[1～3]。p38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路中的关键分子，大量研究证实p38 MAPK活化水平对于包括肺癌、结肠癌和宫颈癌在内的多种肿瘤细胞的增殖、分化、转移、血管生成和肿瘤凋亡有重要的调控作用[4-7]。牛蒡苷(Arctigenin, ATG)是中药牛蒡子的最主要的药理成分，研究发现牛蒡苷具有解热镇痛、抑制炎症反应和抑制肿瘤的作用[8-12]。近期研究证实牛蒡苷的药理作用与促进p38 MAPK活化密切相关[12]。本研究拟观察牛蒡苷对于人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖的影响和相关的分子机制。

1材料和方法

1.1主要试剂和材料人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株从中国科学院上海细胞库购买；牛蒡苷和p38 MAPK抑制剂SB203580均购买于美国Sigma公司；鼠抗人phospho-p38 MAPK抗体、鼠抗人p38 MAPK抗体、鼠抗人caspase-3抗体和鼠抗人β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司。DMEM培养基(美国Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)，DMSO (二甲基亚砜，国药集团化学试剂有限公司)。其余试剂均为分析纯。

1.2细胞培养人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞常规接种在含10%胎牛血清，100 g/L青霉素、100 g/L链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃，5 % CO2，孵箱内培养。每72h换液、传代1次，取对数生长期细胞用于实验。Tca8113细胞分为对照组(Control组)、牛蒡苷干预组(ATG组)及牛蒡苷+p38 MAPK抑制剂SB203580组(ATG+SB组)，共3组。其中对照组细胞加入PBS；ATG组和ATG+SB组细胞加入牛蒡苷(终浓度40μM)；同时ATG+SB组加入SB203580 (终浓度10μM)。使用MTT法对干预后不同时间点(0h、24h和48 h)的细胞活性进行测定，实验重复4次。对应时间点的细胞活性(%) = (样本OD值/对照组OD值) × 100 (%)[13]。

1.3Western blot法检测细胞中caspase-3、phospho-p38 MAPK和total p38 MAPK蛋白表达干预24小时后，提取细胞的蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1小时，分别加入鼠抗人phospho-p38 MAPK抗体(1∶ 1200)、鼠抗人p38 MAPK抗体(1∶1200)、鼠抗人caspase-3抗体 (1∶1000)和鼠抗人β-actin 抗体(1∶1500)，4 °C孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)，用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。使用caspase-3/β-actin和phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK显影强度比值进行蛋白表达量分析。

1.4统计学方法计量资料以均数±标准差表示。采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，两样本均数多重比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1MTT法细胞活性检测使用MTT法对对不同时间点(0h, 24h和48h)的人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞活性进行测定。与对照组相比较，给予牛蒡苷干预的细胞各时间点细胞活性均有降低，差异均有显著统计学意义(P均<0.05)；且各时间点ATG组细胞活性较ATG+SB组下降更加显著，差异均有显著统计学意义(P均<0.05)，见表1。

表1　MTT比色法测定Tca8113细胞活性

注：①与Control组相比较P<0.05；②与ATG组相比较P<0.05

2.2p38 MAPK活性水平分析在干预24h后，使用western blot法对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞p38 MAPK活化水平(phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK)进行分析。与对照组相比，给予牛蒡苷干预后Tca8113细胞phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值明显升高，差异有显著统计学意义(P<0.05)；且ATG组phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值升高水平较ATG+SB组更加明显，差异有显著统计学意义(P<0.05)，见图1和表2。

图1Tca8113细胞p38 MAPK活化的western blot结果

Figure 1Western blot result of the activation of p38 MAPK in Tca8113 cells

Table 2　The activation of p38 MAPK and caspase-3 in Tca8113 cells

注：①与Control组相比较P<0.05；②与ATG组相比较P<0.05

2.3caspase-3活性水平分析在干预24h后，使用western blot法对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞caspase-3活化水平(caspase-3/β-actin)进行分析。与对照组相比，给予牛蒡苷干预后Tca8113细胞caspase-3/β-actin比值明显升高，差异有显著统计学意义(P<0.05)；且ATG组caspase-3/β-actin比值升高水平较ATG+SB组更加明显，差异有显著统计学意义(P<0.05)，见图2和表2。

图2Tca8113细胞p38 MAPK活化western blot结果

Figure 2The western blot result of the activation of p38 MAPK in Tca8113 cells

3讨论

临床研究和流行病学调查发现在全球范围内舌癌在口腔癌中发病率最高。由于社会老龄化和饮食结构改变等原因，舌癌的发病率呈逐年上升趋势，且有年轻化发展的倾向[1-3,14,15]。同时研究发现舌癌的病理类型中鳞状细胞癌多于腺癌，且多发生于舌前部，男性发病率高于女性[1-3,14,15]。一般舌癌的恶性程度较高，易在早期出现较大范围浸润和转移[1-3,14,15]。由于舌器官的特殊性，治疗较为困难，外科治疗具有致残性，导致部分甚至全舌缺如，味觉丧失，严重影响患者生存质量。因此，发掘新的治疗舌癌的药物和方式具有较高的临床价值和意义。

牛蒡苷(Arctigenin, ATG)是中草药牛蒡子最重要的药理成分，目前发现具有包括抑制炎症反应、解热镇痛、调控糖代谢、抑制氧化应激和神经元保护等多种生物活性[8-12]。同时近来多个研究发现牛蒡苷还具有抗肿瘤的药理作用[8-12]。Yang S等人的研究证实牛蒡苷可以促进膀胱癌T24细胞的凋亡[16]。Wang HQ等人发现牛蒡苷可以诱导非小细胞肺癌H460细胞对于顺铂的敏感性[9]。Hsieh CJ等人研究表明牛蒡苷可以促进雌激素受体(ER)阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的发生[12]。本实验中我们使用牛蒡苷和p38 MAPK抑制剂SB203580对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞进行干预后发现，在ATG干预后Tca8113细胞活性相对于对照组呈时间依赖性下降，差异均有显著统计学意义(P均<0.05)；但与ATG+SB组相比较，ATG组下降更加明显，差异均有显著统计学意义(P均<0.05)。该结果表明牛蒡苷对于舌癌Tca8113细胞的增殖有抑制作用。

p38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路中的关键分子，大量研究证实p38 MAPK活化水平对于包括肺癌、结肠癌和宫颈癌在内的多种肿瘤细胞的增殖、分化、转移、血管生成和肿瘤凋亡有重要的调控作用，促进p38 MAPK的活化水平对多种肿瘤细胞有抑制作用[4-7]。Liu J等人发现激活p38 MAPK可以有效的诱导肺癌A549细胞的凋亡[17]。Hui K等的研究证实p38 MAPK对结肠癌HCT116细胞和SW480细胞的凋亡均有调节作用[18]。同时近来多篇文献报道牛蒡苷的生物活性和药理作用与p38 MAPK信号通路的活化密切相关[12, 16]。首先本实验中我们发现牛蒡苷对于Tca8113细胞活性的抑制作用可以被p38 MAPK抑制剂SB203580所拮抗(表1)。进一步对舌癌Tca8113细胞p38 MAPK活化水平使用western blot分析后发现，ATG干预24小时后p38 MAPK磷酸化水平显著增加，差异有显著统计学意义(P<0.05)。且该作用亦可被p38 MAPK抑制剂SB203580所拮抗。该结果表明牛蒡苷对于Tca8113细胞增殖的抑制作用与促进p38 MAPK活化密切相关。caspase-3是肿瘤凋亡调节的关键蛋白，大量研究发现上调caspase-3活化水平可以诱导多种肿瘤的凋亡caspase-3也是p38 MAPK主要的下游分子之一[19, 20]。我们对caspase-3活化水平进行分析后发现，ATG干预24小时后caspase-3活化水平明显增加，差异有显著统计学意义(P<0.05)，但该作用可被p38 MAPK抑制剂SB203580拮抗。该结果表明在舌癌Tca8113细胞中，牛蒡苷可通过p38 MAPK调节caspase-3活化的。

4结论

牛蒡苷可以通过激活p38 MAPK促进caspase-3的活化，从而抑制人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的增殖。该实验为牛蒡苷应用于舌癌和其他肿瘤的临床治疗奠定了一定的基础。

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