胰腺癌细胞中miR-27a靶基因的确定及其意义

·短篇论著·

胰腺癌细胞中miR-27a靶基因的确定及其意义

王慧玲侯宝华区金锐

MicroRNA(miRNA)通过作用于靶基因在肿瘤的发病机制中发挥着癌基因和抑癌基因作用[1-2]。靶基因的预测与鉴定对于肿瘤发病机制的研究有着重要意义。胰腺癌的发生、发展与miRNA的关系密切，有研究报道，胰腺癌组织中的miR-27a明显高表达[3]。本研究结合生物信息学软件，筛选并验证胰腺癌中miR-27a可能的靶基因。

一、材料与方法

1．细胞株及载体：人胰腺癌PANC1细胞系和HEK293T细胞均取自广东省人民医院肿瘤中心实验室，常规培养传代。pmirGLO双荧光素酶报告基因载体购自Promega公司。

2．含靶基因质粒的构建与鉴定：采用生物信息学预测软件Targetscan和miRanda分别对miR-27a进行靶基因预测，并且结合差异表达的蛋白质，选择合适的靶基因。根据生物信息学预测的靶基因和miR-27a结合位点，以人类基因组DNA为模板扩增SMAD4的3′UTR的部分序列，利用DNAclub设计引物序列，在引物中引入XhoⅠ和SalⅠ酶切位点和保护碱基。引物序列上游为5′-TGTCTCGAGAGACCATCCTAGAAACCAC-3′，下游为5′-TGTGTCGACGATCATACCACTGCACTCC-3′。PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳验证，目的条带用DNA胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)纯化回收。根据之前设计的双酶切位点将回收的目的片段与pmirGLO载体分别经过双酶切、连接后构建重组质粒pmirGLO-SMAD4质粒(wt)。将重组质粒转入DH5α感受态细胞进行扩增，挑取阳性克隆37℃培养过夜后提取质粒，进行双酶切和测序鉴定。取上述构建的重组质粒pmirGLO-SMAD4，与miR-27a结合区域第3、4、5个碱基进行定点突变，构建突变型质粒pmirGLO-SMAD4(mut)，按赛百盛碱基突变试剂盒说明书操作，并测序鉴定。

3．细胞转染及双荧光素酶活性检测：取对数生长期HEK293T细胞，以每孔4×105个细胞接种于24孔板中，培养24 h后(细胞融合度达到60%)分别将miR-27a mimic、阴性对照的miRNA-NC(上海吉玛制药技术有限公司)与pmirGLO-SMAD4质粒(wt)/(mut)共转染细胞，按X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent试剂盒(TaKaRa公司)

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.02.017

基金项目：卫生公益性行业科研专项经费项目(201202007)

作者单位：510080广州，广东省人民医院普通外科，广东省医学科学院

通信作者：区金锐，Email: whlhandsome@163.com

说明书操作。培养36 h后收集细胞，用RIPA裂解液(Pierce公司)裂解细胞，采用荧光素酶基因报告基因检测系统(Promega公司)通过多功能酶标仪检测萤火虫荧光素酶活性值(F)和海肾荧光素酶活性值(R)，荧光素酶相对活性以F/R值表示。实验重复3次。

4．SMAD4蛋白表达检测：将胰腺癌细胞PANC1接种于6孔板培养24 h(细胞融合度达到60%)，分别将miR-27a mimic、miRNA-NC瞬时转染细胞。转染72 h后，提取细胞的总蛋白。BCA法蛋白定量后，取30 μg常规行蛋白质印迹法检测SMAD4蛋白表达，以β-actin作为内参。兔抗人SMAD4单抗(Cell Signaling Technology公司)工作浓度1∶1 000，HRP标记羊抗兔IgG(聚研生物科技有限公司)工作浓度1∶5 000。以目的条带与内参条带灰度值比表示蛋白相对表达量。实验重复3次。

二、结果

1．MiR-27a靶基因结合位点预测：经TargetScan和miRanda两种方法预测，miR-27a与SMAD4 mRNA 3′端UTR区互补结合(图1)。经miRNA靶基因数据库-TarBase v．5c筛查及国内外相关文献检索，确定SMAD4与miR-27a的关系尚未见报道。

图1　TargetScan(1A)、miRanda(1B)生物信息学软件预测的miR-27a与SMAD4 mRNA 3′UTR的碱基互补序列(竖线部分)

2．pmirGLO-SMAD4质粒及其突变质粒的鉴定：构建的pmirGLO-SMAD4质粒(wt)，经PCR、双酶切及测序鉴定扩增片段序列正确(图2)。将pmirGLO-SMAD4质粒的SMAD4 3′UTR的结合区域第3、4、5位碱基的TGT突变为ACG(图3)，突变后的质粒送测序，证实突变成功。

3．荧光素酶活性：pmirGLO-SMAD4质粒与miR-27a共转染细胞的荧光素酶相对活性为0.540±0.041，显著低于与miR-NC共转染细胞的1.147±0.089，差异有统计学意义(t=6.154，P=0.003)。突变型pmirGLO-SMAD4质粒与miR-27a共转染细胞的荧光素酶相对活性为1.097±0.018，它与miR-NC 共转染细胞的荧光素酶活性1.111±0.058的差异无统计学意义(t=0.238，P=0.82)。

图2　PCR 产物(2)及双酶切产物(3)的琼脂糖凝胶电泳图

图3　突变型pmirGLO-SMAD4质粒的突变碱基序列(下划线标注)

4．MiR-27a转染对PANC1细胞SMAD4蛋白表达的影响：转染miR-27a的PANC1细胞的SMAD4蛋白表达显著下调(图4)。

图4　转染miR-NC(1)及转染miR-27a(2)的PANC1细胞的SMAD4蛋白表达

讨论MiRNA是非编码RNA，作为转录后水平的调节分子作用于靶基因，促进mRNA的降解或抑制翻译，从而抑制靶基因的表达。大量研究表明[4-6]，多数肿瘤存在miRNA表达谱的改变，胰腺癌同样也存在这一现象[5-6]，因此研究miRNA在胰腺癌发病机制中的作用具有重要意义。

根据前期筛查实验的结果[3]，并结合文献报道，本研究选择了在胰腺癌组织中明显上调的miR-27a作为研究对象。结果显示，含SMAD4质粒与miR-27a共转染细胞的荧光素酶活性明显降低，转染miR-27a的PANC1细胞的SMAD4蛋白表达显著下调，证实miR-27a为SMAD4的靶基因，且对SMAD4进行靶向负调控。

SMAD4位于TGF-β信号通路的中枢位置，是TGF-β/SMAD通路的关键应答分子，与肿瘤的发生、发展有密切关系[7-8]。SMAD4在消化道肿瘤尤其是胰腺癌中的突变率和缺失率最高。Hahn等[9]报道了胰腺癌组织中SMAD4同源缺失或突变现象，认为这种缺失或突变是癌前病变进展为胰腺癌的关键因素，并且是胰腺癌诊断中的一个重要标志物。另一文献[10]通过动物实验证实SMAD4会加速胰腺癌的发生发展。此外，临床资料也表明，SMAD4与肿瘤临床病理特征及患者预后密切相关[11-12]。

参考文献

[1]Ma L, Teruya-Feldstein J, Weinberg RA. Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer[J]. Nature, 2007, 449(7163): 682-688.

[2]Gottardo F,Liu CG,Ferracin M,et al.Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers[J].Urol Oncol,2007, 25(5):387-392.

[3]Ma J, Fang B, Zeng F, et al. Grape seed proanthocyanidins extract inhibits pancreatic cancer cell growth through down-regulation of miR-27a expression[J].Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 2015，40(1): 46-52.

[4]Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers[J]. Nat Rev Cancer, 2006, 6(11): 857-866.

[5]Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs-microRNAs with a role in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2006,6(4): 259-269.

[6]Volinia S, Calin GA, Liu CG, et al. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(7): 2257-2261.

[7]Blobe GC，schiemann WP，Lodish HF．RoIe of transforming growth actor beta in human disease[J]．N Engl J Med，2000，342(18)：1350-1358．

[8]Koyama M, Ito M, Nagai H, et al. Inactivation of both alleles of the DPC4/ SMAD4 gene in advanced colorectal cancers-B：identification of seven novel somatic mutations in tumors from Japanese patients[J]．Mutat Res，1999，406(2-4)：71-77．

[9]Hahn SA, Schutte M, Hoque AT, et al. DPC4, a candidate tumor suppressor gene at human chromosome 18q21.1[J]. Science, 1996, 271(5247): 350-353.

[10]Kojima K, Vickers SM, Adsay NV, et al. Inactivation of Smad4 accelerates Kras(G12D)-mediated pancreatic neoplasia[J]. Cancer Res, 2007, 67(17): 8121-8130.

[11]Watabe T, Miyazono K. Roles of TGF-beta family signaling in stem cell renewal and differentiation[J]. Cell Res, 2009, 19(1)：103-115.

[12]李汉华，侯宝华，区金锐.胰腺癌Smad4蛋白的表达及与肿瘤病理特征和患者生存的关系.中华胰腺病杂志[J],2012,12(2): 138-139.

收稿日期：(2014-12-11)

(本文编辑：吕芳萍)