混菌固态发酵豆粕的工艺优化

■杨 柳 王 磊 张 一 陈宇飞

（吉林工商学院食品工程学院，吉林长春130507）

豆粕是大豆经提取豆油后得到的副产品，营养成分齐全且均衡。发酵豆粕是通过微生物发酵，去除豆粕中的抗营养因子，提高豆粕的营养性能和使用价值，扩大豆粕的使用范围[1]。

我国饲料工业生产中蛋白质饲料资源严重不足，高品质动物蛋白原料鱼粉主要依赖进口[2]，而目前全球性鱼类资源的日趋减少，直接导致鱼粉价格直接上涨，豆粕代替鱼粉已成必然趋势。目前对豆粕固态发酵较多地研究了单菌发酵和两种细菌混合发酵。

刘唤明等[3]研究了由枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌混合发酵生产发酵豆粕的发酵工艺，提高了发酵豆粕的水解度；姚琨等[4]综述了微生物发酵法。

制备发酵豆粕的优缺点，提出了小肽含量、各种氨基酸含量以及发酵前后抗营养因子的变化需要标识等；刘晓艳等[5]以高温豆粕为原料,研究了枯草芽孢杆菌固态发酵法制备多肽饲料的最优发酵工艺；王平[6]在实验室培养条件下,确定了乳酸菌和枯草芽孢杆菌的最佳接种菌龄，得出生物降解是去除抗原蛋白最有效的方法；刘洋等[7]利用4株实验室保藏的菌株对豆粕进行发酵，得出米曲霉在混合体系中对其含量的影响较大。

本文参照行业标准，选择可溶性蛋白和大豆球蛋白为指标，考核豆粕发酵后可利用蛋白的增加量和抗营养蛋白的减少量。采用多菌混合固态发酵豆粕，对其工艺进行研究，多菌混合发酵可以弥补单菌发酵的不足，更好地提高豆粕的营养和降低生长抑制因子。优化工艺条件，为发酵豆粕更好地应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

豆粕：益海嘉里公司购得，化学试剂采用国产分析纯。

菌种：枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌。保存于吉林工商学院食品学院微生物实验室，菌种含量为1×108CFU/ml，菌种比例为1∶1∶1。

设备：SKD-2000凯氏定氮仪：上海沛欧分析仪器厂；SPH2102C立式恒温培养振荡器：上海世平实验设备有限公司；101-2型干燥箱：上海安竞实验设备有限公司；SPX-150B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；YXQ.SG46-280S型手提式灭菌器，西化仪（北京）科技有限公司；BCD-271海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：苏州安泰。

1.2 方法

1.2.1 豆粕发酵工艺

采用张雁平等[8]豆粕发酵工艺方法进行研究。

1.2.2 可溶性蛋白的测定

按照中华人民共和国国家标准GBAT19541-2004获得上清液[9]，通过茚三酮比色法测定上清液中游离氨基酸的含量。

1.2.3 大豆球蛋白的测定

采用王硕[10]酶联免疫吸附方法进行测定。

1.2.4 单因素试验

根据预试验，初步确定菌种添加量5%、发酵时间6 d、发酵温度40℃、初始含水量40%、外源酶的添加量0.3%、初始pH值为7共6个因素，以可溶性蛋白和大豆球蛋白为指标，进行单因素试验。

1.2.5 正交试验

根据单因素试验结果，确定对蛋白含量影响较大的4个因素进行正交试验，优化发酵条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 接菌量对蛋白的影响（见图1）

由图1可知：可溶性蛋白含量随着接种量的增加呈先上升后下降的趋势，即菌种含量过多或过少都对蛋白影响较大；大豆球蛋白的含量正好相反，当含量为4%时达到最低值，之后开始缓慢上升，因此，确定菌种含量为4%时，效果最佳。

2.1.2 发酵时间对蛋白的影响（见图2）

由图2可知：可溶性蛋白的曲线呈现上升的趋势。1～3 d曲线上升明显，是在多种酶的作用下，大分子蛋白的降解速度较快，而酶量减少造成了曲线的平缓，5 d以后，可溶性蛋白急剧增多，说明在微生物的作用下，大分子蛋白开始全面降解；大豆球蛋白的曲线总体呈下降趋势，2～4 d是大豆球蛋白降解高峰期，4 d以后，大豆球蛋白含量相对稳定，说明大豆蛋白已经降解完毕。综合来看，发酵时间为5～7 d，较为理想。

图1 接菌量对蛋白的影响

图2 发酵时间对蛋白的影响

2.1.3 发酵温度对蛋白的影响（见图3）

由图3可知：可溶性蛋白曲线呈现先上升、后下降的趋势，总体变化幅度不大，蛋白含量在110 μmol/g左右。大豆球蛋白的曲线是先下降、后上升的趋势，说明温度对大豆球蛋白含量的影响较大，综合来看，35～45℃范围内，两种蛋白含量较为理想。

2.1.4 初始含水量对蛋白的影响（见图4）

由图4可知：可溶性蛋白含量呈上升趋势，含水量在30%～60%时，可溶性蛋白含量增加明显，说明可溶性蛋白含量与初始含水量具有相关性，而含水量达到一定值以后，含水量的增加对可溶性蛋白含量影响不大，因为含水量的增加促进水解酶的扩散，造成发酵底物多孔性的降低。大豆球蛋白的含量前期呈骤然下降趋势，含水量达40%以后，大豆球蛋白的含量不再变化。综合两个因素，初始含水量在40%～60%较为理想。

图3 发酵温度对蛋白的影响

图4 初始含水量对蛋白的影响

2.1.5 外源酶的添加量对蛋白的影响(见图5)

由图5可知：可溶性蛋白的含量呈上升趋势，酶添加量在0.15%～0.3%时，曲线上升明显，之后上升趋势稍缓，说明酶的添加量对可溶性蛋白的影响较大，但是添加量超过0.6%以后，影响效果不明显。大豆球蛋白的含量随着酶添加量的增加，呈现先下降后上升的趋势，酶添加量在0.3%～0.45%时，曲线最低，说明大豆球蛋白含量最小、降解最快。综合两种蛋白的变化情况，0.3%～0.6%的酶添加量较为理想。

图5 外源酶的添加量对蛋白的影响

2.1.6 初始pH值对蛋白的影响（见图6）

图6 初始pH值对蛋白的影响

由图6可知：随着pH值增加，可溶性蛋白呈现先增加后减少的趋势，而大豆球蛋白则是先降低后逐渐升高的趋势，可见，pH值对蛋白的影响较为明显，当pH值为6.5时最佳。

2.2 发酵条件优化

根据单因素的试验结果，确定菌种添加量为4%，初始pH值为6.5，选定发酵时间、发酵温度、初始含水量、外源酶添加量四个因素，进行4因素、3水平的正交试验，因素水平表见表1，正交试验结果见表2。

表1 因素水平

表2 正交试验结果

由表2可知：对可溶性蛋白含量影响因素顺序为：B＞A＞D＞C。最佳组合为A3B2C1D2。即：发酵时间为7 d、发酵温度40℃，初始含水量为40%、外源酶添加量为0.45%。

对大豆球蛋白含量影响因素顺序为：B＞A＞C=D。最佳组合为A3B2C3D2，即发酵时间为7 d、发酵温度40℃，初始含水量为60%、外源酶添加量为0.45%。

从影响因素看，对大豆球蛋白含量影响因素的初始含水量与外源酶的添加量相同，因此总的影响因素顺序为B＞A＞D＞C；从最佳组合上看，初始含水量差别较大，考虑到含水量过多，会增加较大的干燥成本，确定初始含水量为40%。因此总的最佳组合为A3B2C1D2。

2.3 验证试验结果

根据正交试验结果，菌种添加量为4%，初始pH值为6.5、发酵时间为7 d、发酵温度40℃，初始含水量为40%、外源酶添加量为0.45%，进行验证试验，试验结果为可溶性蛋白的含量为168.5 μmol/g，大豆球蛋白的含量为11.2 μmol/g，效果理想。

3 结论

研究了混菌固态发酵的工艺条件，以可溶性蛋白和大豆球蛋白含量为评价指标，通过单因素试验，确定了菌种添加量为4%，初始pH值为6.5。做了发酵时间、发酵温度、初始含水量、外源酶添加量的4因素3水平的正交试验，得出：最佳组合为A3B2C1D2，即发酵时间为7 d、发酵温度40℃，初始含水量为40%、外源酶添加量为0.45%。

根据正交试验结果进行验证试验，该条件下可溶性蛋白的含量为168.5 μmol/g，大豆球蛋白的含量为11.2 μmol/g，效果理想。