体外产气法评价南方经济作物副产物对肉牛的营养价值

■马俊南 司丙文 李成旭 王世琴 刁其玉 屠 焰

（1.中国农业科学院饲料研究所，北京100081；2.金陵科技学院，江苏南京 211169）

我国南方土地肥沃，日照充足，适合多种经济作物的生长，而南方作为反刍动物饲料的饲草则多数为稻草，种类单一；桑叶、麻叶等大多数种类的南方经济作物副产物具有产量大，营养物质丰富的特点，但目前都未被广泛使用，大部分被焚烧或是闲置浪费，这不仅造成了资源浪费，而且对大气环境造成了很大程度的污染[1]。为加快南方反刍动物养殖行业的快速发展，合理利用饲料资源是关键。开发利用新的饲料资源，饲料的营养含量是否满足动物的生长需要是最需要衡量的因素，因此需对其进行营养价值评定，针对其营养特性饲喂牲畜是合理利用的前提[2-4],体外产气法由于能够较好地模拟瘤胃中的发酵过程[5-7]，且可通过分析饲料对瘤胃发酵产气量、pH值、氨态氮（NH3-N）和挥发性脂肪酸（VFA）浓度及体外干物质降解率（IVDMD）等指标的影响，对判断饲料中的能氮是否符合瘤胃微生物发酵所需，是否可被高效利用具有重要地位。自Menke等[8]成功应用体外产气法预测发酵底物的营养价值以来，该技术因其简便、经济、评价效率高等优点最终成为了一种评价反刍动物粗饲料营养价值的一种简单有效的方法。孟庆翔等[9]的一系列研究证明了体外产气法与体内法有很高相关性（R＞0.97)，使得该方法越来越多地应用在反刍动物饲料的营养研究领域。Aghsaghali等[10]用体外产气法评价干番茄皮渣的营养价值，试验结果表明，番茄皮渣可以作为一种有价值的副产品应用于反刍动物饲料中。Akinfemi等[11]用体外产气法评价了5种尼日利亚农业副产品饲料的营养价值，结果表明体外产气法能用于评价热带农业副产品的营养价值和区别它们的潜在可消化性和代谢能值，并证明了这些农业副产品具有成为反刍动物日粮的潜力。国内也做了大量相关试验，丁角立(1983)[12]首次将人工瘤胃产气法用于牛饲料营养价值的评定，并与体内消化试验结果相比较，获得了较满意的结果。近年来针对新型饲料资源开发利用的研究越来越多，而具有地域特点的大量而系统的营养参数数据还较为缺乏，特别是南方所拥有的丰富的经济作物副产物，需要对其饲料营养价值进行研究，从而广开饲料资源。本试验通过运用体外产气法针对部分南方经济作物及其副产物进行试验，旨在根据数据的分析对粗饲料营养价值进行评价，筛选出适合反刍动物生长的原料，为南方经济作物及其副产物的有效利用以及新型饲料资源的开发利用提供基本参数。

1 材料与方法

1.1 参试样品

南方经济作物及其副产物（桑叶、麻叶、红苕藤、柑橘渣、花生藤、甘蔗梢等）15个参试样品的采样信息如表2，采集后干燥阴凉处密封保存。

1.2 试验动物及饲养管理

试验采用单因素设计，在中国农业大学肉牛研究中心挑选3头健康、体重(600±40)kg、装有永久性瘤胃瘘管的利木赞×复州黄牛杂交阉牛为试验动物，预饲期为2周。试验牛的试验用日粮的组成及营养成分见表1。日粮精粗比为3∶7，每天饲喂2次(08：00和16：00)，自由饮水，单槽饲养。试验期于晨饲前采集瘤胃液。

1.3 体外产气试验方法

1.3.1 样品称量

采用德国制造特种玻璃注射器为培养管，长度27 cm，内径3 cm，在100 ml范围内具有刻度显示，最小分度1 ml。准确称取待测样品约200 mg（DM），置于体外培养管底部（注意不要让样品进入产气管注入口和沾染30 ml以上管壁），样品称取完毕后，管塞上均匀涂抹凡士林，将管塞塞回对应的外管，扣好夹子后将培养管置于65℃恒温箱内保存待用。

表1 试验日粮组成及营养水平(干物质基础)

1.3.2 人工瘤胃培养液的配置以及瘤胃液的采集

采用Menke等[8]的方法配制人工瘤胃营养液原液，具体配方参照Zhao等[13]的配制方法执行。

晨饲前抽取3头牛的瘤胃液，抽取后放入保温瓶内，并迅速带回实验室，以防止微生物区系发生改变。正式培养前将瘤胃液混合均匀后经4层纱布过滤，量取所需体积（瘤胃液与人工瘤胃营养液的体积比为1∶2）的瘤胃液迅速加入到准备好的人工瘤胃营养液中，制成混合人工瘤胃培养液。混合人工瘤胃培养液边加热边用磁力搅拌器搅拌，同时通入无氧CO2，将缓冲液pH值调整至6.9～7.0，39℃水浴30 min。

1.3.3 体外培养

水浴完成后，用自动分液器向每个培养管中分别加入30 ml上述混合培养液。排尽培养管内气体后夹住前端硅橡胶管，记录初始刻度值(ml)，同时做5个空白（只有培养液而没有底物）。将上述培养管迅速放入已预热(39℃)的水浴箱中，完成后转入人工瘤胃培养箱中开始培养，记录起始时间。

1.3.4 产气量测定

当培养至0、2、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、42、48、60、72、84、96、108、120 h各时间点时，取出培养管，快速读取活塞所处的刻度值(ml)并记录。若某一时间点读数超过80 ml时，为了防止气体超过刻度而无法读数，应在读数后及时排气并记录排气后的刻度值。

1.3.5 培养终止并取样

参试样品在体外培养条件下培养24、48、120 h后，将培养管快速取出并放入冰水浴中，发酵停止。将培养管中的发酵液排出至5 ml对应编号的塑料离心管中，立即用pH计测定发酵液pH值并记录。发酵液经低温离心(4℃、8 000 g、15 min)，取上清液冷冻保存以备其他发酵参数（VFA、NH3-N等）的测定。

1.4 测定指标与测定方法

1.4.1 常规营养成分

参试样品首先在65℃条件下烘干48 h，粉碎至40目左右。在实验室条件下进行干物质、有机物、粗蛋白、粗脂肪等常规样品成分分析测定。

干物质（Dry matter，DM）含量测定参照张丽英[14]的方法；粗蛋白(Crude protein，CP)含量采用全自动凯氏定氮仪测定；粗灰分含量采用马弗炉灰化法，有机物(Organic matter，OM)=100-粗灰分含量；粗脂肪(Crude fat，CF)采用ANKOM全自动仪器测定，中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber，ADF)采用 Van Soest[15]纤维分析方法。非纤维碳水化合物（Non-fiber carbohydrate,NFC）=100-（NDF%+CP%+FAT%+ASH%）参照孟庆翔（2001）[16]的方法。

1.4.2 累积净产气量（ml/0.2 g DM）

净产气量（ml/0.2 g DM）=某时间段产气量（ml/0.2 g DM）-对应时间段3支空白管平均产气量（ml/0.2 g DM）。

1.4.3 发酵参数

将不同种参试样品在不同时间点（0、2、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、42、48、60、72、84、96、120 h）的产气量带入基于Ørskov[17]产气模型GP=a+b(l-e-ct)，根据非线性最小二乘法原理计算产气参数a、b、c值。式中：GP为t时刻的产气量(ml)；a为快速产气部分；b为慢速产气部分；c为慢速产气部分的产气速度常数；a+b为潜在产气量（Orskov等，1980）。

1.4.4 发酵液pH值

用pH 计(Sartorius PB-10，Sartorius Co.德国)测定，精度为0.1。

1.4.5 发酵液氨态氮（NH3-N）的测定

氨态氮含量采用苯酚-次氯酸钠比色法测定（Broderick等，1980）[18]，每支试管加入100 μl经适当倍数稀释的样本液或标准液，向每支试管中加入5 ml的苯酚试剂，摇匀后向每支试管中加入4 ml的次氯酸钠试剂，并摇匀，将混合液在95℃水浴中加热显色反应5 min，冷却后在630 nm波长下UV-VIS8500分光光度计比色。

1.4.6 发酵液挥发性脂肪酸（VFA）浓度的测定

分别取发酵24 h及48 h后的澄清瘤胃液，以5 400 g转速离心10 min，取1 ml离心上清液，加入0.2 ml 25%(w/v)偏磷酸溶液，混匀，在冰箱中过夜，再次以5 400 g转速离心10 min，取上清液待测，以2-乙基丁酸为内标，采用气相色谱仪（型号SP-3420，北京分析仪器厂）和玻璃填充柱进行测定。

1.4.7 体外干物质消化率

干物质消化率（DM，%）=（样本DM重-残渣DM重+空白管DM重）/样本DM重×100。

1.4.8 数据统计分析

数据均需采用Excel 2013进行初步整理，利用初步整理后净产气量，采用SAS9.2处理软件NLIN(Nonlinear regression)程序计算a、b、c值等发酵参数，降解参数、pH值以及挥发性脂肪酸含量，氨态氮浓度采用单因素方差分析（one-way ANOVA）程序进行分析，差异显著则用DUNCAN法进行多重比较。当P＜0.05时为差异显著。

2 结果

2.1 参试样品常规营养成分

通过进行实验室样品成分测定，15种参试样品的常规营养成分见表2（以DM为基础），由表中可知，CP含量上，桑叶、红苕藤较高，甘蔗渣最低；NDF含量，甘蔗渣最高，柑橘渣最少；各种原料的有机物含量均在90%以上。参试样品的NFC含量差别较大，含量最高的是柑橘渣，为54.28%，其次是红苕藤、木薯渣和花生藤，分别为31.51%、30.63%和30.31%。油菜籽荚、玉米壳、麻叶、竹叶的NFC含量均较少，尤其竹叶最少，NFC含量仅为仅为2.01%。

表2 参试样品的采样信息及营养成分（干物质基础）

表2 （续） 参试样品的采样信息及营养成分（干物质基础）

2.2 产气量

2.2.1 各个时间点的产气量

由表3可知,随着体外培养时间的延长,各组参试样品产气量总体呈逐级递增趋势，并大部分在96 h左右时产气量的产气呈现平缓的趋势。其中以柑橘渣在各个时间点产气量最多，在120 h时达到了66.41 ml。桑叶、花生藤、笋壳、玉米壳在120 h的产气量也均在45 ml以上，这可能跟桑叶的高蛋白以及花生藤、笋壳、玉米壳中的高纤维含量有关。木薯渣、甘蔗渣、毛豆秸、红苕藤、油菜籽荚的产气量也都在30 ml以上。麻叶的产气量为16.28 ml，在15种参试样品中是最低的。

表3 不同种参试样品的产气量(ml)

表3 （续） 不同种参试样品的产气量(ml)

2.2.2 6种参试样品的产气曲线

如图1分别选取了桑叶、柑橘渣、毛豆秸、花生藤、玉米壳、象草6种具有代表性的参试样品。由图可看出各个参试样品产气过程的动态变化，所有参试样品的大致的产气趋势相同，产气前期产气速度较快，曲线斜率明显，后期产气速度减慢，直至变成直线,均在120 h左右产气达到最大值。

从曲线可看出0～24 h为产气量上升最快的时间段，24～48 h产气量增长速度减慢，72～120 h趋于平缓，120 h后产气量几乎不再增加，参试样品中柑橘渣在各个时间点的产气量及产气速度均明显高于其余5种。花生藤和桑叶的产气趋势大致相同，总产气量也相近。从图1中也能看出，毛豆秸的主要产气阶段集中在0～24 h，这区别于其他原料的主要发酵时间为0～72 h。

图1 6种参试样品的产气量动态变化情况

2.3 体外发酵参数

由表4可得，从体外发酵动力学参数来看，这几种参试样品的快速产气部分a皆为负值，因为在快速降解开始前都存在一个延滞时间；慢速产气部分b值，柑橘渣最高为66.35 ml，明显高于其他参试样品（P＜0.05），其次是玉米壳、笋壳、花生藤、桑叶，其慢速产气部分均在40 ml以上。

大体上可以看出在本试验中，作物渣类、作物藤类以及作物壳类的慢速产气部分要相对于其他种类高。b值最小的是竹叶和麻叶。产气速率常数c值最高的是柑橘渣和木薯渣，分别为0.092和0.075，毛豆秸、桑叶、象草等次之，值也均在0.05以上，产气速率常数最低的是麻叶、油菜籽荚和甘蔗渣，只有0.02左右。最大产气量a+b值最高的是柑橘渣，其次为玉米壳、笋壳和桑叶，都在40 ml以上，麻叶的潜在产气部分最少，只有18.24 ml，几乎只占最高值柑橘渣的1/3。从一系列发酵参数数值来看，各种参试样品的发酵情况不尽一致，且几乎都差异显著。

表4 不同种参试样品的体外发酵参数

2.4 24 h及48 h的发酵液挥发酸产量、氨态氮浓度、pH值及体外干物质消化率。

由表5可知，在发酵至24 h时，不同参试样品的总VFA浓度不同，含量最高的是柑橘渣，为53.57 mmol/l，其次为花生藤，桑叶、毛豆秸、红苕藤、甘蔗梢、笋壳、玉米壳、象草也均在40 mmol/l以上，它们之间差异不显著（P＞0.05）。柑橘渣发酵液在24 h时的乙酸浓度依次高于红苕藤、玉米壳、笋壳、象草、毛豆秸（P＞0.05），竹叶乙酸浓度最低（P＜0.05）。柑橘渣、花生藤、甘蔗梢、笋壳、玉米壳、象草的丙酸浓度均在8.50 mmol/l以上，差异不显著（P＞0.05）。

24 h发酵液中，红苕藤和柑橘渣的NH3-N浓度分别为25.84、7.57 mg/100 ml，仅是最高值的1/3（P＜0.05）。

表5 不同种参试样品培养24 h时发酵液中挥发性脂肪酸及氨态氮浓度、pH值及体外干物质消化率

不同种参试样品在24 h时的pH值在6.58～6.94之间，能够保持瘤胃酸碱性的平衡。

24 h时的IVDMD(体外干物质消化率)以柑橘渣、红苕藤、花生藤最高，分别是56.18%、47.84%、40.03%，显著高于甘蔗渣以及油菜秸秆的11.52%、14.89%。桑叶、麻叶、毛豆秸、甘蔗梢、玉米壳、油菜秸秆、象草的IVDMD则集中在30%～40%。

表6为不同参试样品体外发酵48 h的VFA、NH3-N浓度和pH值大小，不同种参试样品在发酵至48 h时，发酵液种VFA以及NH3-N浓度相对于24 h是均有不同幅度的上升，总挥发性脂肪酸浓度最高的依然是柑橘渣，为62.48 mmol/l，而总挥发酸浓度增长最多的是桑叶，增加浓度为15.81 mmol/l，其中乙酸增加量为9.51 mmol/l。油菜秸秆、甘蔗梢、象草的总挥发酸浓度几乎保持不变。乙酸增加浓度最多的是笋壳，增加浓度为7.89 mmol/l，木薯渣、玉米壳的增长量也均在7.18 mmol/l以上，而象草的两个时间点的乙酸浓度则变化不大。氨态氮浓度增加最多的是红苕藤，增加值为9.01 mg/100 ml，pH值则依然保持在6.6～6.9之间，维持平衡。柑橘渣在培养至48 h时体外干物质消化率达到62.42%，在所有参试样品中依然保持最高值（P＜0.05）。其次是红苕藤和笋壳，为55.60%和47.41%。甘蔗渣此时的消化率为16.84%，显著低于其他参试样品（P＜0.05）。

3 讨论

体外产气法（In Vitro Gas Production）是目前发达国家采用最多的用来评价反刍家畜饲草饲料营养价值的技术之一[19]，它能够较好地模拟瘤胃发酵过程。不同时间段内的体外产气量在某种程度上反映了底物被瘤胃微生物发酵利用的情况，可以作为衡量底物营养价值高低的因素，也是用产气法预测干物质降解率最主要的指标[20]，一般情况下，由于体外模拟的瘤胃发酵环境毕竟有别于牛瘤胃的实际的生理状况[21]，所以大多数研究体外产气方法时都要结合原料的各种不同营养成分的含量、发酵参数以及模拟环境的变化情况，这样使预测结果将更加准确。本试验则主要通过测定产气量、挥发性脂肪酸浓度、氨态氮浓度、pH值以及体外干物质消化率的值来综合分析参试样品在反刍动物上的饲用价值。

表6 不同种参试样品培养48 h时发酵液中挥发性脂肪酸及氨态氮浓度、pH值及体外干物质消化率

3.1 产气量

根据Menke[8]最早提出的人工瘤胃产气量法评价饲草料的营养价值，体外发酵产气量成为反刍动物瘤胃底物发酵的一个很重要的指标[22]。Murillo等[23]用体外产气法评价了放牧阉牛日粮营养价值随季节性的变化规律，结果表明，体外产气量是评价放牧牛日粮营养价值的一个很好的指标。当体外利用缓冲瘤胃液消化饲料时，碳水化合物会降解成短链的脂肪酸、气体和微生物的细胞成分[24]。气体主要是碳水化合物在降解为乙酸、丙酸、丁酸的过程中产生的，与碳水化合物相比，蛋白质降解时的产气量要低[25]。本试验中各种饲料体外发酵产气量动态变化曲线表明，饲料发酵有一个过程，在初始阶段发酵不完全，产气量较少；当到一定的时期，产气量开始达到最高峰，然后逐渐下降，各种样品在96～120 h产气曲线上升缓慢；到120 h时，产气曲线几乎都不再上升，变成一条直线。

不同的饲料产气量达到最高峰的时间不同，柑橘渣在本试验中最早达到产气高峰，而且在每个时间点的产气量以及总的产气量都明显高于其他参试样品，这与柑橘渣中含有非纤维性碳水化合物（NFC）含量较高有关；柑橘渣中的NFC主要为可溶性糖和果胶质[26],较易被发酵。另外木薯渣、花生藤以及笋壳等的发酵情况均明显好于甘蔗梢、油菜秸秆等，这与任莹等[27]的研究相一致。麻叶在本次试验中产气量，产气速率等都明显低于其他参试样品，试验中发现麻叶由于本身质量较轻且发酵初始很难溶于发酵液，这可能是它发酵前段时间的产气不明显，整个发酵过程产气缓慢且产气量较少的原因之一。

3.2 体外产气发酵参数

体外产气参数可以间接反映饲料在瘤胃中的消化情况[28]，有研究表明，快速降解部分即a值与CP含量正相关，b值和a+b值主要与无灰分NDF的含量和消化性成正相关[29]，在本试验中甘蔗渣、玉米壳、笋壳的a值较低而b值则相对较高，可能由于这些参试样品中所含的CP较少，而NDF含量则相对较高有关。柑橘渣的b值最高与它有较好的消化性以及其内含有的可溶性糖以及果胶质有一定关系，可溶性糖和果胶在瘤胃中发酵较快[30-31]。a+b值即潜在产气量，最大的是柑橘渣、玉米壳，分别为65.79 ml和54.52 ml，这与以上提到的潜在产气量与NDF含量呈正相关也是相符合的。

3.3 挥发性脂肪酸浓度

瘤胃碳水化合物发酵的主要产物是乙酸、丙酸和丁酸等VFA，它们是反刍动物主要的能量来源[32]。因此VFA的产量及其比例可显著影响反刍动物对营养物质的吸收、利用和生产能力的发挥[20]。试验表明，产气量较高的试验原料总挥发性脂肪酸的浓度也相对较高，这与张元庆等[1]的研究结果相符合。柑橘渣、玉米壳、笋壳、花生藤在24 h和48 h的总挥发性脂肪酸浓度分别为 53.57 mmol/l和 62.48 mmol/l、48.97 mmol/l和 59.66 mmol/l、47.24 mmol/l 和 59.48 mmol/l、49.04 mmol/l和50.22 mmol/l。桑叶在24 h的总挥发性脂肪酸浓度为42.49 mmol/l，而在48时增长至58.30 mmol/l，是所有样品中增长最多的，可能原因为桑叶中含有相对较多的粗蛋白，所以产气量在24 h至48 h迅速增多。乙酸/丙酸值的大小与能量利用效率成线性相关[33]，本试验中红苕藤的该比值最高（P＜0.05）,其他参试样品的乙酸/丙酸值也均在3.0以上，能量利用效率很接近。

3.4 氨态氮浓度

氨态氮浓度可反映蛋白质合成与降解所达到的平衡状况，以及饲料氮降解速度和微生物对氨的利用[34]，另外，NH3-N是瘤胃内饲料蛋白质、肽、氨基酸、氨化物、尿素和其它非蛋白氮化合物分解的终产物，所以NH3-N浓度是评价瘤胃内环境的重要指标[20]。本试验通过测定各种参试样品外发酵24 h及48 h后培养液中氨态氮浓度来研究其在瘤胃内降解与利用情况。很多研究表明瘤胃NH3-N浓度在采食后呈先上升后下降的趋势[35-36]，在本试验结果中，24 h与48 h的氨态氮浓度的变化趋势是不一致的，大部分参试样品的48 h氨态氮浓度要比24 h时的高，其中差异最明显的是桑叶，其次是木薯渣、甘蔗渣、玉米壳、上升值均在10 mg/100 ml以上。而油菜秸秆、花生藤、油菜籽荚、象草在48 h的氨态氮浓度比24 h的低，其中降低最明显的是油菜秸秆，降低值为5.28 mg/100 ml，这与不同种参试样品的特性有关。

3.5 pH值

体外产气发酵液的pH值代表的是参试样品发酵影响下的瘤胃环境总酸度的变化情况，可以反映瘤胃微生物、代谢产物有机酸产生、吸收、排除及中和的状况，瘤胃酸度对维持瘤胃内环境相对恒定具有主导作用，是瘤胃发酵过程的综合指标[37]，它影响着瘤胃微生物的区系和活性，缓冲液的酸碱度是否与瘤胃液的pH值保持一致直接影响体外产气效果[27]，其变动范围一般为5.5～7.5[33]，最适宜范围为6.6～7.0，可以保证瘤胃微生物的生长[38]。本试验中，经过测定不同种瘤胃发酵液在培养24 h和48 h时的pH值均保持在6.0～7.0，这与Satter等[39]报道的瘤胃微生物合成的最适pH值范围相一致，说明了瘤胃培养液的酸碱环境一直处于能够保持瘤胃微生物具有正常活性的状态。

3.6 体外干物质消化率

体外干物质消化率可以用来了解饲料的消化情况并反映饲料消化的难易程度[40]，本试验中柑橘渣、红苕藤、花生藤、笋壳均表现出较好的易消化性。这与郝正里等[41]的研究饲料粗蛋白质和粗纤维含量与其体外干物质消化率存在的相关关系相符合。24 h与48 h相比，消化率均有不同程度的上升，其中最明显的是油菜秸秆、笋壳、象草。这几种参试样品的NFC含量均较低，可能是其中原因之一。而竹叶、甘蔗渣、甘蔗渣的体外消化率相对较低，结合其NDF及ADF可知这与文亦芾等[18,42]的研究结果中的体外干物质消化率与NDF、ADF呈极显著负相关相一致。

4 结论

在本试验测定的15种样品中，产气过程集中在0～72 h，产气量以及产气速率由于营养成分的不同存在差异，但都能在120 h左右达到平衡。

综合产气量以及发酵参数可知，柑橘渣、木薯渣、桑叶、红苕藤、花生藤、笋壳、花生壳、象草具有较高的营养价值，可作为优质粗饲料开发利用。竹叶、木薯渣、甘蔗渣、毛豆秸、甘蔗梢、油菜籽荚发酵特性次之，但仍然可以适量添加。而麻叶、油菜秸秆对反刍动物来说营养价值较低，不宜作为饲料大量饲喂。