胶体金免疫层析法检测谷物中的黄曲霉毒素B1

■杜兵耀 马 晨 余 雄

（新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐830052）

霉菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，目前已知的霉菌毒素种类有400多种[1]。其中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是致癌性、毒性和污染频率最强的毒素之一[2]。1987年国际癌症中心将AFB1定为人类有足够证据的致癌剂[3]。由于AFB1的危害大，一旦污染难以除去，且饲料原料在生产、收获、储存过程中容易受到AFB1的污染。黄志伟等[4]采集了8个饲料企业41份谷物样品进行检测，其中共14份谷物样品中含有AFB1，检出率达34.15%。伏春燕[5]对山东省87份玉米样品进行AFB1的检测，检出率高达98.85%，超标率为3.45%。张秀珠[6]对全国采集的84份谷物样品进行AFB1的检测，检出率高达96.4%，结果显示谷物中普遍存在AFB1，但安全性总体良好。因此要加强对谷物中AFB1的检测。

传统的AFB1的检测方法主要有薄层层析法、酶联免疫吸附法（ELISA）和高效液相色谱法[7-8]。上述方法对试验条件和检测技术有较高要求，检测时间长，操作复杂，不能满足现场快速检测的要求。因此需要研制出快速、简单、经济的检测方法，用于谷物中AFB1的检测。胶体金免疫层析是最快速的检测方法之一，已经得到了广泛的应用。胶体金免疫层析试纸条检测技术是以抗原或抗体作为分析的基础物，利用免疫层析法对待测物进行定量分析的方法[9]。该技术特异性强、灵敏度高、操作简单，已经应用于医学、食品、环境以及农牧业等领域[10]。本试验使用胶体金免疫层析法检测谷物中AFB1，以确定是否可以检出AFB1超出国家限量标准的样品。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

高效液相色谱；数显恒温水浴锅；紫外检测器；离心机；超声波清洗器；超纯水仪；电子精密天平；粉碎机（20目筛）；试纸条孵育器。

1.1.2 试剂

甲醇、乙腈为色谱纯；黄曲霉毒素B1（Sigma美国公司）；黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析试纸条[中检环贸生物技术（北京）有限公司]；样品（采集于北京各牛场）。

1.2 试验步骤

首先使用国家标准规定的高效液相色谱法对加标样品进行检测，同时检测AFB1的质控标准样品，确定结果的准确性。然后使用胶体金免疫层析试纸条进行快速检测并对比，验证胶体金免疫层析试纸条检测方法的可行性。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

准确称取粉碎后的谷物（细度为全部通过20目筛）样品10.00 g于50 ml离心管中，加入20 ml 70%的甲醇，涡旋1 min，超声20 min后，10 000 r/min离心5 min，取上清液300 μl。

1.3.2 样品母液的配制

用甲醇溶解AFB1的标准品，用70%的甲醇-水溶液稀释，得到100 ng/l的标准储备液。

1.3.3 样品加标

分别称取10 g玉米、小麦、豆粕样品，准确加入2 ml 100 ng/l的AFB1标准储备液，混匀。样品处理方法同1.3.1。

1.3.4 胶体金免疫层析法检测及结果分析

胶体金免疫层析试纸条插入孵育器内，将300 μl样品加到试纸条的样品仓内，孵育5 min，如果出现任何以下一种情况（见图1），均视为无效：①C线（质控线）不出现；②T1、T2(检测线)或者C线严重不均匀；③待测样品溶液掩盖或者模糊了T1、T2或者C线；④胶体金微粒没有通过T1、T2或者C线。

图1 无效的情况

1.3.5 胶体金层析法试纸条灵敏度检测

用70%甲醇-水溶液稀释标准储备液，得到AFB1最终浓度分别为 1、5、10、20 ng/ml的标准溶液。用试纸条检测的标准方法检测，并和高效液相色谱法进行比较，判断免疫层析胶体金试纸条的检测灵敏度。

1.3.6 胶体金免疫层析试纸条检测谷物样品

将添加AFB1的谷物样品和未添加AFB1的谷物样品用试纸条的标准方法检测，并和高效液相色谱法进行比较。

2 结果与分析

2.1 胶体金免疫层析试纸条灵敏度检验

使用70%的甲醇-水溶液为阴性对照，读数结果为0。当加入300 μl 1 μg/l的AFB1标准溶液时，读数结果为1，当加入300 μl 10 μg/l的AFB1标准溶液时，读数结果为10（见表1）。表明灵敏度符合我们的要求，且所有试纸条可用于此检测体系中AFB1的检测。将3种加标样品进行检测，并和高效液相色谱对比结果基本一致（见表2），表明该试纸条可以用于饲料原料样品中AFB1的检测。

表1 两种方法对AFB1标准溶液进行比较验证

表2 不同谷物原料中加标溶液的对比验证

2.2 胶体金免疫层析试纸条的检测结果

打开试纸条孵育器，水平放置并保持清洁，设定温度为45℃。待孵育器温度达到45℃时，将试纸条平放入孵育器内。撕开试纸条的薄膜至指示线处，分别取不同种类300 μl的样品加到样品室中，然后将粘箔粘回。盖上孵育器的盖子，孵育5 min。取出试纸条，插入读数仪读取结果（见表3）。

表3 不同种类的样品检测结果(μg/kg)

3 结论

免疫层析试纸条法检测前处理简单，5 min就可以定量的检测出饲料原料中黄曲霉毒素B1的残留值。该试纸条灵敏度高，价格便宜，稳定性好，操作简单，适用于现场大批量的快速检测，也可以在偏远地区广泛的应用，可以有效地防止黄曲霉毒素B1中毒现象的发生。