高山杜鹃组织培养中褐化控制的研究

朱小茜　齐婷婷

摘 要：为降低高山杜鹃组织培养中外植体的褐化程度，实验对高山杜鹃组织培养中不同的外植体（顶芽、叶片、带腋芽的茎段）、不同的基本培养基和不同的抗褐化剂等进行了研究。结果表明，高山杜鹃不同的外植体褐化率不同，其中带腋芽的茎段的褐化率最低；活性炭对外植体褐变起到了很好的抑制作用，其中以添加1.0g/L的活性炭时外植体褐化率最低。

关键词：高山杜鹃；组织培养；褐化；抗褐化剂

中图分类号 S685 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）24-46-03

Abstract：To overcome the explants browning in tissue culture process of Rhododendron lapponicum，the different explants，different antioxidants and different basic mediums were tested in this study.The results indicated that the browning rate of different explant was different.Stem section with axillary buds had the lowest browning rate. Explants browning could be effectively prevented in the medium contained 1.0g/L activated carbon.

Key words：Rhododendron lapponicum；Tissue culture；Browning；Antioxidant

高山杜鵑（Rhododendron lapponicum）又名红山茶，是杜鹃花科高山常绿灌木或小乔木植物，多生长在海拔较高的山地阴坡上，花朵有白色、粉色、红色等多种颜色，色泽鲜艳，呈球形开放，作为礼品花和新兴的年宵花卉，深受人们的喜爱[1]。但是高山杜鹃含有黄酮类化合物、多酚类物质，在组织培养时其外植体容易产生褐化现象，使其生长、分化受到抑制，甚至死亡[2]。为此，本实验对高山杜鹃组织培养过程中褐化现象的控制进行了研究，以期为高山杜鹃组织培养提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试外植体材料采自安徽省霍山，取生长旺盛的高山杜鹃新生叶片、顶芽和带腋芽的幼嫩茎段，用水冲洗掉表面灰尘。在超净工作台上用浓度为1‰的升汞消毒8min，无菌水漂洗4次。

1.2 试验设计

1.2.1 不同外植体的褐化现象 外植体分别取新生叶片、顶芽、新梢上带腋芽的茎段，切取为大小适中的小块接种在1/4MS+TDZ0.2mg/L+IAA0.4mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L的培养基中培养，pH为5.5。叶片切成边长为1～1.5cm的正方形，带腋芽的茎段取大约1cm长。每种外植体接种20瓶，每瓶接入1个外植体，3次重复。

1.2.2 不同的基本培养基对高山杜鹃褐变的影响 切取长约1cm的带腋芽的幼嫩茎段分别接种于以下4种基本培养基中：Read、MS、1/2MS、1/4MS，每一培养基中都添加TDZ0.2mg/L+IAA0.4mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH为5.5。每种培养基20瓶，每瓶接入1个带腋芽的茎段，3次重复。

1.2.3 抗褐化剂对高山杜鹃褐变的抑制 在1/4MS+TDZ0.2mg/L+IAA0.4mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L培养基中分别添加不同的的抗褐化剂：活性炭（O.5，1，1.5g/L）、聚乙烯吡咯烷酮PVP（0.4，0.8，1.2g/L），pH为5.5。每种培养基20瓶，每瓶接入1个带腋芽的茎段，3次重复。

1.2.4 培养条件 培养温度：22～24℃；光照时间：11h/d；光照强度：2 500lx。

1.3 统计分析 每隔4d观察并记录外植体的褐化及生长情况，36d后对数据进行统计分析。相关计算公式如下：

褐化率（%）=（褐变的外植体总数/接种的外植体总数）×100；

增殖系数=增殖的芽总数/接种的外植体总数。

褐化程度采用目测法：“+”表示轻度褐化；“++”表示中度褐化；“+++”表示重度褐化。

2 结果与分析

2.1 不同外植体的褐化现象 高山杜鹃在组织培养时用不同材料作为外植体其褐化程度不同。从图1可以看出，用新生叶片作为外植体时，20d后完全褐变，褐化率为100%，褐化程度非常严重，培养基表面产生了一种褐色物质；顶芽的褐变程度仅次之，其褐化率为73%；带腋芽的幼嫩茎段褐化率为57%。接种后32d，顶芽褐化率上升至93%，带腋芽的茎段的褐化率也增至80%。这是由于高山杜鹃新生叶片内含有很多酚类化合物，接种前又进行切割，伤口面积很大，培养过程中受伤细胞内的多酚类物质慢慢溢出，被氧化成褐色的醌类物质，这些醌类物质发生作用后使外植体蛋白质聚合，导致其死亡[3]。顶芽比带腋芽的茎段褐化率高，这可能是由顶芽中含有的大量的多酚类物质和不同的內源激素共同作用的结果[4]。

2.2 不同基本培养基对高山杜鹃褐变的影响 高山杜鹃带腋芽的茎段在不同基本培养基上其褐化程度不同。从图2可以看出，外植体在1/4MS培养基上褐化率最低。4d后每种培养基中都开始出现褐化，并且褐化程度逐渐增强。接种24d后，1/4MS培养基中的褐化率达63%，褐化程度较轻，并且产生了少量的丛生芽，而1/2MS培养基中褐化率为83%，Read培养基的褐化率达到了90%，MS培养基中褐化率也高达87%，外植体褐变程度较严重。接种后32d，Read和MS培养基的褐化率增至100%，1/2MS中增至97%，1/4MS为80%。由此看出，植物细胞的褐化受基本培养基影响较大，培养基中含有高浓度的无机盐，诱导外植体中酚类化合物大量溢出，进而加剧了外植体的褐化[5]。因此，降低培养基中无机盐浓度可以抑制酚类物质的外溢，减缓褐变。

2.3 不同的抗褐化剂对高山杜鹃褐变的抑制作用 不同种类及不同浓度的抗褐化剂对高山杜鹃组织培养的抗褐化效果不同，结果如表1所示。從表1可以看出，活性炭（AC）对高山杜鹃外植体褐化有较强的抑制作用，在加入1.0g/LAC的培养基中褐化程度最轻。不加任何抗褐化剂时，32d后褐化率达到80%。添加0.5g/LAC的培养基中，其褐化率在32d后降至48%，褐变程度减轻，增殖系数为1.3。在添加1.0g/L活性炭时，32d后褐化率减至38%，褐化程度最轻，而且分化出了长势良好的丛生芽，增殖系数为1.9。当添加AC的浓度增加为1.5g/L时，在组织培养早期褐变程度相对较轻，然而培养32d后褐化率增加为45%，增殖系数减少为1.5，丛生芽生长减缓。这是由于AC吸附性很强，高浓度的AC在吸附醌类等有毒物质的同时，也吸附了培养基的营养，从而阻碍了丛生芽的生长和分化[6]。AC能够降低高山杜鹃组织培养的褐化率，但必须要选择适宜的浓度。从表1还可以看出，培养基中添加了0.4～1.2g/LPVP，外植体褐变率达67%～75%，褐变程度稍有减轻，但增殖系数增加不明显。本次实验中PVP对高山杜鹃组培过程中褐变的抑制效果不显著，这可能是由于PVP不能吸收高山杜鹃外植体中的一些多酚类物质及其衍生物。

3 讨论与结论

3.1 不同外植体的褐化现象 高山杜鹃带腋芽的茎段作为组织培养的外植体时褐化程度最轻；顶芽的褐化程度其次，新生叶片最严重，培养20d时褐化率即达100%。这可能与外植体的生长部位和面积有关。所以高山杜鹃组培快繁时尽量选用带腋芽的幼嫩茎段。

3.2 不同基本培养基对高山杜鹃褐变的影响 实验结果表明，高山杜鹃在MS培养基中褐变程度最严重，但在1/4MS培养基中褐化率最低。培养基中含有无机盐浓度越高，外植体外溢的酚类物质越多，褐化越严重。因此将培养基中无机盐含量适度降低，能有效减轻高山杜鹃外植体的褐化程度。

3.3 不同的抗褐化剂对高山杜鹃褐变的抑制 在培养基中添加不同的抗褐化剂都能一定程度地减轻高山杜鹃外植体的褐变。其中，以加入AC时抑制作用较显著，其浓度为1.0g/L时效果最佳，褐化率减为38%，增殖系数最大，新生芽长势良好。而添加0.4～1.2g/LPVP对高山杜鹃褐化的抑制作用不明显。

参考文献

[1]李志斌.高山杜鹃将成为我国高档园林园林绿化的新秀[J].农业科技与信息，2007，19（7）：82-85.

[2]钟国华，胡美英.杜鹃花科植物活性成分及作用机制研究进展[J].武汉植物学研究，2000，18（6）：509-514.

[3]沈海龙.植物组织培养[M].北京：中国林业出版社，2005.

[4]朱小茜.毛豹皮樟组织培养过程中褐化控制研究[J].安徽科技学院学报，2013，27（3）：33-36.

[5]梁巧玲，赵鹏.西洋杜鹃组织培养影响因素分析[J].江苏农业科学，2010（2）：19.

[6]周艳，陈训.活性炭在高山杜鹃组织培养中的应用[J].安徽农业科学，2008，36（4）：30. （责编：张宏民）