硝酸银硅胶柱梯度洗脱法纯化桐酸甲酯

硝酸银硅胶柱梯度洗脱法纯化桐酸甲酯*

刘芸双，傅伟昌

(吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000)

摘要：以桐油和甲醇为原料，在NaOH催化下通过酯交换反应制备桐油酸甲酯，再采用硝酸银硅胶柱梯度洗脱法对反应产物进行分离纯化，获得桐酸甲酯.应用GC-MS，IR，UV，HPLC对反应产物进行分析检测和表征，桐酸甲酯纯度达95%，可用于合成桐酸单甘酯、甘二酯，以备深入研究桐酸及其甘油酯化物的生理活性.

关键词：桐酸甲酯；桐酸；桐油；制备；纯化；表征

文章编号：1007-2985(2015)01-0052-05

中图分类号：TQ646文献标志码：A

DOI:10.3969/j.issn.1007-2985.2015.01.012

收稿日期：*2014-09-05

基金项目：湖南省科技厅科技计划项目(2010FJ4117)；吉首大学校级课题(13JDY054)

作者简介：刘芸双(1988—)，女，山东烟台人，吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室硕士研究生，主要从事油脂化学研究 通信作者：傅伟昌(1969—)，男，湖南沅陵人，吉首大学研究员，博士，主要从事油脂化学研究.

共轭亚麻酸(Conjugated linolenic acid，CLNA)是一组十八碳共轭三烯酸的统称，因双键位置和构型不同而有多种异构体.α-桐酸(9c,11t,13t-CLNA，α-eleostearic acid，α-ESA)是天然存在的一种重要的共轭亚麻酸，在桐油和苦瓜籽油中大量存在[1-4].研究结果表明，CLNA具有抗癌(细胞毒性)[1-5]、抗致癌(抑制肿瘤形成)、改变脂代谢和增强机体免疫[6-7]等多种生理功能，动物体内代谢可转变为cis9,trans11-CLA[8-9].

天然油脂与甲醇的酯化反应是制备生物柴油的重要工艺过程.油桐是我国4大木本油料植物之一，具有易种植、成本低、产量高等优点.以桐油和甲醇为原料制备生物柴油(脂肪酸甲酯的混合物)的研究已见报道.笔者制备、纯化、表征桐酸甲酯是计划以桐酸甲酯为原料，合成桐酸单甘酯、甘二酯，以备深入研究桐酸及其甘油酯化物的生理活性.

1实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：桐油，张家界市家家耀油脂厂；甲醇、氢氧化钠、硝酸银、石油醚、乙醚，天津市科密欧化学试剂有限公司，AR；乙腈、正己烷、异丙醇，上海阿达玛斯有限公司，HPLC；硅胶，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司.

仪器：7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；Agilent 1206型高效液相色谱仪，美国Aglient公司；U-3900型紫外可见分光光度计，日本日立公司；Nicolet iS10型傅立叶变换红外光谱仪，美国Thermo Scientific公司；AEL-40SM十万分之一分析天平，日本岛津公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司.

1.2 桐酸甲酯的合成

在250 mL的三口烧瓶中加入一定质量的桐油(100 g)，安装冷凝回流装置，置于恒温水浴锅中加热；桐油达到实验所需温度(70 ℃)后，加入配制好的NaOH甲醇溶液，甲醇按与桐油物质的量之比6∶1的比例加入，NaOH为桐油质量的1%，开启磁力搅拌，反应约1 h后，停止反应，加适量磷酸中和.趁热将反应液转移至分液漏斗，静置，分出甘油层(下层)，将上层的液体用热蒸馏水洗涤2～3次，除去下层的水相，常压下蒸馏，除去甲醇及大部分水等.用无水硫酸钠干燥，即得到桐油甲酯化产物[10-11].

1.3 桐酸甲酯的分离纯化

桐酸甲酯的分离纯化采用硝酸银硅胶柱层析法.

硝酸银硅胶的制备[12]：称取100 g层析硅胶(100～200目)加入含有20 g硝酸银的水溶液160 mL(使其浸没硅胶)，在沸水浴中加热30 min(时加搅拌)，冷却，抽滤，在120 ℃的条件下活化16 h以上，备用.

装柱[13]：取活化后的硝酸银硅胶，加入适量石油醚，搅拌，匀浆后静置1 h，使硅胶充分溶胀.在层析柱底部加入约1 cm高的石英砂，加入20 mL石油醚，将溶胀后的硅胶缓慢地倾入，柱外用黑纸包裹，用石油醚平衡2 h后使用.

上样：待层析柱内液面高于硅胶面0.5 cm时，开始上样.称取一定质量的桐油甲酯化样品，缓慢滴加入柱内，注意不要使硅胶面有浮动.

洗脱[14]：洗脱体系为含有乙醚的石油醚混合液，依次用v乙醚∶v石油醚=0∶1，2∶98，4∶96，5∶95，6∶94各100 mL，以1～1.5 mL/min洗脱流速进行梯度洗脱，每40 mL收集液为一个样品，按收集顺序编号，直至桐酸甲酯被洗脱完全.分析收集液中桐酸甲酯的含量.

1.4 桐酸甲酯的分析

1.4.1 GC-MS分析对桐油甲酯化后未经硝酸银硅胶柱分离的混合脂肪酸甲酯和各段收集液稀释到合适的浓度后分别进行GC-MS分析[15].

色谱条件：Agilent 190191S-433型石英毛细管柱(325 ℃，30 min×250 min×0.25 μm)，载气为高纯度的氦气(99.999%)，柱内载气流速为1 mL/min；升温程序为150 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至230 ℃，保持20 min，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；分流比5∶1；进样量1 μL.

质谱条件：电离方式EI，电子能70 eV，离子源温度230 ℃，溶剂延迟3 min，四级杆质量分析器.

1.4.2 HPLC分析对桐油甲酯化后未经硝酸银硅胶柱分离的混合脂肪酸甲酯和桐酸甲酯含量最高的洗脱收集液分别进行HPLC分析[16].

色谱条件：色谱柱(Kromasil 100-5C18,250×4.6 mm)，紫外检测器检测波长270 nm；柱温35 ℃；进样量20 μL.流动相A：乙腈，B：v异丙醇∶v正己烷= 5∶4，0 min时70% A+30% B，20 min内变为50%A+50%B，10 min内变为100%B，流速0.6 mL/min.

1.4.3 UV分析对桐酸甲酯含量最高的洗脱收集液进行UV分析.扫描范围400～200 nm.

1.4.4 IR分析采用美国Nicolet iS10型傅立叶变换红外光谱仪对桐酸甲酯含量最高的洗脱收集液进行IR分析.扫描范围4 000～400 cm-1，扫描次数32次，分辨率4 cm-1.

2结果与讨论

2.1 GC-MS分析

桐油甲酯化后未经硝酸银硅胶柱分离的混合脂肪酸甲酯及纯化后所得的桐酸甲酯，经GC-MS分析的总离子流见图1，2.

图1　桐油混合脂肪酸甲酯的GC-MS总离子流

图2　纯化后桐油酸甲酯的GC-MS总离子流

根据图1的保留时间和峰面积可以得出各个峰所代表的脂肪酸及其占总脂肪酸的比例.桐油中各类脂肪酸及其相对含量见表1.

表1　桐油主要脂肪酸组成

注：序号1，6因相对含量过低，在图形中无法体现，故图1中未标出.

由图1及表1可知，在该条件下桐油混合脂肪酸甲酯中的各脂肪酸甲酯组分都得到了很好的分离[17].据GC-MS分析结果及文献[18-21]，出现在保留时间为22.26，24.86，25.47 min的峰可判断为桐酸甲酯峰，峰面积很大，反映出桐油中的主要脂肪酸为桐酸，约占70.71%，是桐油的特征脂肪酸.除此之外，桐油中还检测出其他7种脂肪酸，分别为9.27%的饱和脂肪酸(2.87%的棕榈酸、3.98%的硬脂酸、2.42%的花生酸)，12.35%的油酸，9.39%的亚油酸及少量的亚麻酸(0.66%)，不饱和脂肪酸占93.13%，各脂肪酸含量与文献报道的桐油中脂肪酸组成含量基本一致(其脂肪酸组成因产地、品种、加工方法、贮存等条件不同而稍有差异).由以上分析可知，桐油中不饱和脂肪酸组分存在形式较多且集中，共轭十八碳三烯酸的存在则决定其可能具有不同的生物活性功能[22].

对经硝酸银硅胶柱处理的各段收集液进行GC-MS分析，结果见表2.

表2　收集液中脂肪酸甲酯的相对含量　%

由图2及表2可知，桐油甲酯化混合物中的桐酸甲酯经硝酸银硅胶柱得到了很好的分离、纯化，纯度达95%以上.

2.2 高效液相色谱法分析

图3为桐油甲酯化未经硝酸银硅胶柱分离的混合脂肪酸甲酯的HPLC图谱.图4为桐酸甲酯含量最高的洗脱收集液的HPLC图谱.

图3　桐油混合脂肪酸甲酯的HPLC图谱

图4　纯化后桐酸甲酯的HPLC图谱

因共轭亚麻酸不稳定，没有商品化的α-桐酸标准品提供，故在HPLC分析中，确定α-桐酸相对含量的方法不是很完善.笔者根据桐油混和脂肪酸甲酯的GC-MS结果，对比其HPLC图谱(图3)，可知图4中保留时间为6.18 min的峰为桐酸甲酯峰，通过相对峰面积归一化定量[16]，α-桐酸的相对含量与表2基本吻合，达到95%.对比图3和图4可知，硝酸银硅胶柱对桐酸甲酯的分离效果很好.

2.3 UV分析

共轭脂肪酸在紫外区有最大吸收峰，共轭双键越多，最大吸收峰越向长波方向移动.共轭三烯酸在260，270，280 mn左右有3个吸收峰，双键的顺反结构对吸收峰的位置略有影响[23].图5为桐酸甲酯含量最高的洗脱收集液在200～400 nm波段内的全波长扫描图谱.由图5可看出，桐酸甲酯的最大吸收峰出现在269 nm处，呈现共轭三烯酸的特征吸收峰，与文献[23]报道的共轭亚麻酸的特征吸收波长范围基本相符，出现的差异可能是因溶剂不同而导致.

2.4 IR分析

图5　桐酸甲酯紫外光谱图

图6　桐酸甲酯红外光谱图

3结论

桐油脂肪酸成分较为简单，主要脂肪酸为桐酸，含量达70.71%.以桐油和甲醇为原料，NaOH为催化剂的桐油甲酯化反应，综合GC-MS，HPLC，UV，IR分析结果，反应产物主要为桐酸甲酯.利用硝酸银硅胶柱，以加入不同比例乙醚的石油醚为洗脱液对反应产物进行分离纯化，GC-MS跟踪监测分离产物，结果表明硝酸银硅胶柱分离效果良好，桐酸甲酯的纯度可达95%以上.

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Purification of Methyl Eleostearate by the AgNO3-Silca Gel

Column Gradient Elution Method

LIU Yunshuang,FU Weichang

(Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering,

Jishou University,Zhangjiajie 427000,Hunan China)

Abstract:Fatty acid methyl esters of tung oil were synthesized by transesterification of tung oil and methanol with NaOH as catalyst.The AgNO3-silca gel column gradient elution method was used for the separation of reaction product to obtain methyl eleostearate.The methyl eleostearate was characterized by GC-MS,IR,UV and HPLC.The purity of the final methyl eleostearate was found to be 95%.For further study of biological activities of eleostearic acid and its glyceryl ester compound,the methyl eleostearate can be used to synthesize monoglyceride and diglyceride of eleostearic acid.

Key words:methyl eleostearate;eleostearic acid;tung oil;synthesis;purification;characterization

(责任编辑向阳洁)