反相液相色谱中调整流动相组分比例对分离效果的影响

反相液相色谱中调整流动相组分比例对分离效果的影响

黄强1李华勇1刘新国2

(1.江西省吉安市质量技术监督检测中心，江西 吉安 343000；

2.江西省产品质量监督检测院，江西 南昌 33000)

摘要：用国标法同时测定苯甲酸、山梨酸和糖精钠，通过改变流动相组分比例，即改变流动相极性，对三种比例所得出的分离效果进行比较，考察了三种组分的保留时间、分离度及拖尾因子等参数变化。试验结果表明：(1)增加甲醇比例，三种待测组分保留时间都提前，且糖精钠的变化最大；(2)增加甲醇比例可以使三种组分的分离度和拖尾因子都变小，同时也可以满足对分离度的要求；(3)综合分析试验所得各参数，得出色谱系统所需最适流动相配比，实现较好的分离效果，试验的精密度也满足要求。

关键词：液相色谱流动相分离度系统适用性试验

反相色谱法是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种色谱分离模式，是基于样品中的不同组分和固定相之间作用的不同而将各组分分离，具有柱效高、分离能力强、保留机理清楚等特点，是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种。反相色谱系统中的固定相一般采用硅胶表面键合疏水基团，流动相首选甲醇-水系统，在一些大分子物质的分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，添加一定量的乙腈或甲醇等与水互溶的有机溶剂作流动相。

色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其中，分离度和拖尾因子是考察分离效果的重要指标。实际检测中，各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。

笔者根据自己多年该方面工作的实际经验出发，以国标法测定苯甲酸、山梨酸和糖精钠为试验方法。在色谱系统的适用性试验时，通过改变甲醇在流动相中的比例，实现了待测组分较好的分离效果。

1、材料与方法

1.1　仪器与试剂

岛津LC-2010A型高效液相色谱仪，配紫外检测器，色谱工作站。

苯甲酸、山梨酸、糖精钠混合标准溶液：浓度均为0.100 mg/mL。

乙酸铵为分析纯，甲醇为色谱纯，试验用水为超纯水。

1.2　仪器工作条件

色谱柱为C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱温为30 ℃；检测器为紫外检测器，检测波长为230 nm；流动相为甲醇与0.02 mol/L乙酸铵的混合溶液；流速为1.0 ml/min；进样量为10 μL。

1.3　试验方法

本文试验采用GB/T 23495-2009中对苯甲酸、山梨酸、糖精钠的测定方法，甲醇与0.02 mol/L乙酸铵溶液分别过0.45 μm微孔滤膜，通过改变甲醇与乙酸铵溶液的体积比来调节流动相的极性，采用甲醇与0.02 mol/L乙酸铵溶液体积比分别为：5：95、10：90和15：85三种比例来进行，将苯甲酸、山梨酸、糖精钠混合标准溶液进样10 μL，在仪器工作条件下进行测定，比较不同比例下混合标准溶液中三种组分的保留时间、分离度及拖尾因子等参数的变化。

2、结果与讨论

2.1　流动相比例的选择

调整流动相组分比例时，一方面以组分比例较低者(小于或等于50%)相对于自身的改变量不超过±30%且相对于总量的该变量不超过±10%为限，如30%相对改变量的数值超过总量的10%时，则改变量以总量的±10%为限；另一方面，对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%。故本文采用5：95、10：90和15：85三种比例来进行。

2.2　三种组分保留时间的变化

保留时间是待测组分从进样到出现峰最大值所需的时间。理论上来说，保留时间越长越有利于组分分离，但时间越长，待测组分在柱子里扩散越严重，越容易影响分析结果，而且人力及试剂损耗等成本也越高。

通过比较三张色谱图1、2、3及表1、2、3可知：甲醇在流动相比例的较小变化都会使苯甲酸、山梨酸、糖精钠的保留时间发生明显的改变。增加甲醇在流动相中的比例，可以使得苯甲酸、山梨酸、糖精钠的保留时间提前；糖精钠的保留时间变化更大，由原来的最后出峰变为最先出峰。

图1　色谱图(甲醇：乙酸铵=5：95)

序号名称保留时间(min)分离度拖尾因子1苯甲酸10.9970.02.272山梨酸15.1095.42.273糖精钠21.8416.32.36

图2　色谱图(甲醇：乙酸铵=10：90)

序号名称保留时间(min)分离度拖尾因子1苯甲酸8.9410.02.162山梨酸11.9434.82.173糖精钠13.6872.42.13

图3　色谱图(甲醇：乙酸铵=15：85)

序号名称保留时间(min)分离度拖尾因子1苯甲酸7.5200.02.152糖精钠9.3413.403山梨酸9.7620.70

2.3　三种组分之间的分离度

分离度的大小表示待测组分与相邻共存物之间的分离程度，可以通过测定待测组分之间的分离度来对色谱系统进行评价与控制。分离度是两个相邻组分的保留值之差与其平均峰宽值之比，用R表示，当R>0.8时，两组分不能完全分离；当0.8

2.4　三种组分的拖尾因子

拖尾因子反映了色谱峰的对称性，可以用于评价待测组分之间的分离效果和测量精度。一般来说拖尾因子越小，反应出的分离效果也越好。通过比较表1、2、3可知，随着甲醇在流动相中的比例增加，三种组分的拖尾因子变小，峰形更尖锐。

2.5　最佳流动相比例

综合考虑保留时间、分离度及拖尾因子等参数，选择甲醇与0.02 mol/L乙酸铵溶液体积比为10：90作为试验方法，能实现苯甲酸、山梨酸和糖精钠三种组分较好的分离效果。

2.6　精密度试验

按2.5选择的试验方法做精密度试验，测定6次，其中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的相对标准偏差分别为：0.12%，0.14%，0.11%，符合不大于2.0%的要求，说明试验方法可以得出较好的测量精度。

参考文献

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[6]张丽平，蒋旎.国标法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠的分析探讨[J].中国调味品，2014，(5)：87-89.

The effect of adjusting the mobile phasecomponents ratio on separation

efficiency in reversed phase liquid chromatography

HUANG Qiang1LI Hua-yong1LIU Xin-guo2

(1.Ji’anMunicipalCenterforSupervisionandInspectionofQualityandTechnology，Jiangxi，Ji’an343000；

2.JiangxiProvincialProductQualitySupervisionTestingCollege，Jiangxi，Nanchang33000)

Abstract：Simultaneous determination of benzoic acid，sorbic acid and saccharin sodium by GB method，changing the mobile phase components ratio，that is，changing the polarity of mobile phase，compared the separation efficiency of three components，inspected the changing of parameter include retention time，resolution and tailing factor.The test results show that：(1)Increasing the proportion of methanol，the retention time of three components shift to an earlier time，and the maximum change of saccharin sodium；(2)Increasing the proportion of methanol can decrease the resolution and tailing factor of three components，can also meet the requirement for the resolution；(3)The comprehensive analysis of the parameters obtained in the test shows that the optimum ratio of mobile phase for the chromatographic system，and the better separation effect，the precision can also meet the requirement.

Key Words：Liquid chromatographyMobile phaseResolutionTest of system suitability