寇氏隐甲藻发酵产DHA藻油的动力学模型研究

王 澍 曹 维 付 杰 田 华 陈 涛 何东平

寇氏隐甲藻发酵产DHA藻油的动力学模型研究

王 澍1曹 维1付 杰1田 华1陈 涛2何东平1

（武汉轻工大学食品科学与工程学院1，武汉 430023）
（中国科学院武汉病毒研究所2，武汉 430071）

本文利用Logistic方程和Luedeking-Piret方程对寇氏隐甲藻发酵产DHA藻油动力学进行研究。通过测定寇氏隐甲藻在50 L发酵罐中生物量、油脂产量、DHA产量、葡萄糖浓度的变化，建立了菌体生长、产物形成和基质消耗的动力学模型，同时对试验值与模拟值进行了比较，平均相对误差大部分小于10%。通过对发酵过程的曲线拟合以及模型参数的计算，模型相关指数分别为：0.993、0.996和0.978，模型模拟计算结果与试验值能较好地吻合，说明所建立的发酵动力学模型能够较好地反映寇氏隐甲藻的发酵过程，为其工业化生产提供科学依据。

寇氏隐甲藻 动力学模型 Logistic方程 Luedeking-Piret方程

二十二碳六烯酸（DHA）是一种ω-3系多不饱和脂肪酸（PUFA）。近年来，DHA因对人体健康的突出作用而备受关注。DHA市场需求量的增大，使得利用海洋微藻和真菌发酵生产DHA藻油成为当前新途径［1-4］。在众多海洋异养甲藻中，寇氏隐甲藻现已被确定为DHA的高产藻种之一，可在没有光照的条件下发酵培养，从而实现细胞的增长和油脂的积累，其细胞生产的大量油脂中DHA的含量远高于其他多不饱和脂肪酸，可以说寇氏隐甲藻在生产DHA藻油方面具有极大优势［5-8］。

在菌种的发酵生产过程中，菌体生长、产物积累和底物消耗是最为关键的几个因素。发酵前期的菌体生长和发酵中后期的产物的积累都取决于发酵液中底物浓度。而产物的积累同时也取决于菌体生长状况。通过对发酵过程的动力学模型进行研究，可以了解发酵过程底物、菌体生长和产物积累的相关关联关系，可以预测发酵进行的程度，估算底物消耗速率，了解产物生成情况［9-10］。

由于Logistic方程和Luedeking-Piret方程能很好地反映菌体生长以及产物形成等情况，且在分批发酵中应用非常广泛，所以决定采用这2种方程建立模型。在寇氏隐甲藻发酵的不同时间段取发酵液样品进行菌体生物量、油脂产量和葡萄糖浓度的测定，对发酵过程进行分析后，用Logistic方程和Luedeking-Piret方程，建立起寇氏隐甲藻发酵过程中菌体生长、产物形成和基质消耗的动力学模型。为寇氏隐甲藻产DHA藻油工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 藻种

ATCC30772寇氏隐甲藻株：广东微生物菌种保藏中心；2.4k-2A2-5寇氏隐甲藻突变株：经过2次60Co-γ射线诱变获得，本实验室保存［11］。

1.2 试剂

葡萄糖、氯化钠、碳酸氢钠、硫酸钠：天津博迪化工股份有限公司；酵母膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；谷氨酸钠：上海如吉生物科技发展有限公司；硫酸镁：国药集团化学试剂有限公司；氯化钴：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；正己烷：天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸二氢钾、氯化钙：天津市凯通化学试剂有限公司；无水乙醇：天津天力化学试剂有限公司；纤维素酶（10～140万U／g）、碱性蛋白酶（20万U／g）：江苏锐阳生物科技有限公司；所用的试剂均为分析纯。

1.3 仪器与设备

GRJ-50B型发酵罐：镇江格瑞生物工程有限公司；Agilent 7890A气相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；SPX-150C恒温恒湿箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1F单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；LDZX-75KB立式蒸汽灭菌器：武汉利天科技仪器有限公司；RE-52C旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。

1.4 方法

1.4.1 培养条件

种子培养：从长好藻种的斜面上取一定量纯的藻落，接种到一级种子培养液中，置于摇床上，pH 6.5，26 ℃、180 r／min 条件下培养48 h。

50 L发酵罐培养：将二级种子液按10%的接种量接种到50 L发酵罐中，28℃培养48 h然后降温到22℃，通气量30 L／h，190 r／min条件下培养至放罐。

1.4.2 生物量测定

寇式隐甲藻的生物量以收集的藻体细胞干重计。取一定体积的培养液装入预先称重的离心管中，5 000 r／min离心20 min，沉淀用蒸馏水清洗3次，置于干燥箱中，45℃条件下烘干，称重（至恒重）。

生物量＝干菌体质量／发酵液体积

1.4.3 葡萄糖浓度测定

吸取5 mL碱性酒石酸铜甲液与5 mL碱性酒石酸铜乙液，置于150 mL锥形瓶中，加10 mL水，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加比预测体积少1 mL的试样溶液至锥形瓶中，使在2 min内加热至沸，保持沸腾继续以1滴／2 s的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。同法平行操作3份，得出平均消耗体积（如果样品残糖浓度偏低，可先加入一定量的标准葡萄糖溶液，再滴加试样溶液滴定至终点）。

1.4.4 油脂提取

将湿藻体按湿重∶纯净水为1∶1～1∶3的比例，制成悬浮液，加碱性蛋白酶和纤维素酶，（60±1）℃水浴温培，同时搅拌8 h，镜检藻体破壁后，加入95%乙醇脱水30～60 min，静置分层，使乙醇-水相与藻泥分层。将乙醇-水相和藻泥分别加入4号溶剂油，分装2个分液漏斗中，静置分层。取出上层4号溶剂油藻油相提萃液。反复浸提，至藻泥变白无油为止。把4号溶剂油提萃液经旋转蒸发，获得粗藻油，粗藻油经脱胶除杂等过程后获得金黄色精藻油。

油脂产量＝油脂质量／发酵液体积

1.4.5 DHA产量测定

藻油脂肪酸甲酯化：取0.1 g油样，加1 mL苯-石油醚（体积比为1∶1）混合溶剂，再加1 mL 0.4 mol／L的氢氧化钾-甲醇溶液，摇匀，在室温下静置8～10 min，然后加蒸馏水使醚层升至顶部，待液层澄清后即可作色谱分析。

气相色谱条件：色谱柱：Agilent SP-2560（100 m×25μm，0.2 μm）；升温程序：100 ℃ 保持4 min，以3 ℃ ／min升温至230 ℃，保持20 min，载气（N2）流速25 mL／min，压力2.4 kPa，进样量1 μL；分流比15∶1。

DHA产量＝油脂产量×DHA含量

1.4.6 数据处理

用所得数值在Logistic方程和Luedeking-Piret方程的基础上，建立寇氏隐甲藻发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物形成的动力学模型。应用Orige 8.5软件处理试验数据和模型，拟合出所有模型参数，建立发酵动力学数学模型。

2 结果与分析

2.1 寇氏隐甲藻发酵

寇氏隐甲藻发酵过程曲线如图1所示。寇氏隐甲藻的生物量、油脂含量、DHA产量、葡萄糖浓度随发酵时间的延长而变化。在最佳发酵条件的基础上，进行发酵代谢过程研究，发酵时间设定为120 h。发酵0～24 h为生长延迟期，菌体浓度增长缓慢，油脂和DHA开始积累。发酵24～96 h为对数期，菌丝体生长迅速，还原糖大幅度下降，油脂和DHA快速积累。发酵96 h后，菌体的生物量和DHA产量基本趋于稳定，菌体生物量在120 h时达到最大值为61.30 g／L，此时，菌体中油脂产量高达27.31 g／L。由图1可知，其油脂合成和菌体生长呈部分相关。

图1 寇氏隐甲藻的发酵过程曲线

2.2 寇氏隐甲藻生长模型

菌体生长动力学最常用方程有Mond方程和Logistic方程［12］。由于Mond方程是理想化模型有一定的局限性，而Logistic方程是一个典型的S型曲线，能很好地反映发酵过程中普遍存在的菌体浓度增加对自身生长的抑制作用，所以采用Logistic方程构建菌体生长动力学模型较为合适，Logistic方程为：

以方程（2）对图1中的菌体生物量试验值进行非线性拟合，可以求得参数μmax＝0.112，Cx，o＝0.54，Cx1max＝61.30，代入方程（2）可得：

根据试验结果，以菌体生物量Cx对生长时间t作图。从图2可知，该模型的拟合值和试验值基本一致，相关系数R2＝0.993，说明此模型能较好地反映寇氏隐甲藻的生长过程。

图2 菌体生长的发酵试验值与模型拟合值的比较

2.3 产物形成模型

由图1可以看出油脂的合成与菌体生长没有直接相关性，即油脂的合成与菌体生长属于部分耦联关系，因此选用Luedeking-Piret方程来描述寇氏隐甲藻发酵过程中油脂合成规律，它可以同时反映与菌体生长耦联的产物形成的速率，也可反映独立于菌体的通过细胞催化形成产物的速度，该模型可以适用于一般的发酵过程，即：

式中：α，β为模型参数，P为油脂质量分数／%，当t＝0时，P0＝0。

将方程（1）代入方程（4）得：

把方程（2）代入方程（5）积分得：

以方程（6）进行拟合，求得方程参数α＝0.269 7，β ＝0.002 5，代入方程（6）中，寇氏隐甲藻发酵过程中油脂合成模型如下：

从图3可知，该模型的拟合值和试验值基本吻合，模型的相关系数R2＝0.996，说明此模型较好的反映了寇氏隐甲藻发酵过程中的油脂积累过程。

图3 菌体发酵过程中油脂产量试验值与模型拟合值的比较

2.4 底物消耗模型

菌体发酵过程中，底物的消耗一方面用于细胞的增殖，另一方面则用于产物的合成及其代谢，因此，底物消耗速度可由Luedeking-Piret-Like方程表示：

式中：Yx／s为对底物菌体生长的得率系数，g（菌体干重）／g（葡萄糖）；Yp／s为对底物产物的得率系数，g（产物）／g（葡萄糖）。ms为葡萄糖用于维持细胞生命常数，g（葡萄糖）／g（菌体干重）／h。

将方程（1）、方程（4）代入方程（8）中，积分整理可得：

按方程（9）对发酵过程中的葡萄糖浓度试验值进行非线性拟合，得到基质消耗量关于时间的方程：

根据方程（10）将模型拟合值和实际值进行比较（见图4），除个别点外，拟合值和实际值基本吻合，模型的相关系数R2＝0.978，说明此模型能较好反映寇氏隐甲藻的底物消耗过程。

图4 菌体发酵过程中底物消耗试验值与模型拟合值的比较

2.5 模型验证

为了检验模型误差，在同等发酵条件下进行3个批次试验，所得数据取平均值，与动力学模型的模拟值进行比较，得出细胞生长、油脂形成及葡萄糖消耗的理论值与试验值的平均相对偏差分别为4.04%、3.66%和4.57%。寇氏隐甲藻发酵动力学模型的误差检验的详细结果见表1。

表1 试验值与预测模拟值的比较

由表1可知，模型预测值与试验值符合得较好，平均相对误差大部分小于10%。该结果表明，所建立的动力学模型能较好的描述寇氏隐甲藻发酵过程中菌体生长、产物形成及底物消耗的变化规律。

3 结论

微生物反应过程是非常复杂的体系，关系到发酵培养基中的营养成分、培养温度、通气量等条件，对其进行精确描述几乎是不可能的。因此，在发酵过程中建立机制模型要进行合理的简化，采用均衡生长的非结构模型。即在细胞的生长过程中，细胞内各种成分均以相同的比例增加，菌体为单组分，不考虑环境对菌体组成的影响，采用较为简化的方式，对关键变量进行考虑，忽略次要因素，并据此建立较为简便，便于分析验证，易实现计算自动化的数学模型［13-14］。

研究结果表明，在发酵前期，油脂的增长趋势明显滞后于菌体细胞生长，此时葡萄糖消耗不大，但底物消耗的模拟值与试验值有较小的偏差，可能是发酵初期，罐内搅拌不均匀导致的。菌体细胞生长进入稳定期后，生物量快速增长，葡萄糖的大量消耗使得油脂产量显著提高，当生物量趋于稳定时，油脂继续合成，由此认为寇氏隐甲藻发酵生产DHA藻油分为菌体生长和产物合成2个阶段，产物合成属于部分生长耦联型。

通过对发酵过程的曲线拟合以及模型参数的计算，模型相关指数分别为：0.993、0.996和0.978，说明所构建的模型与实际生长情况吻合度较好，模型的计算结果在一定程度上揭示了寇氏隐甲藻发酵代谢的动力学特征，可用来预测发酵体系中产物的合成和底物的浓度，制定补料工艺，优化发酵工艺参数，实现发酵过程的集约化，为工业化生产提供参考。

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Study on Fermentation Kinetics for DHA Algae Oil Production by Crypthecodinium Cohnii

Wang Shu1Cao Wei1Fu Jie1Tian Hua1Chen Tao2He Dongping1
（School of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University1，Wuhan 430023）
（Wuhan Insitute of Virology，Chinese Academy of Sciences2，Wuhan 430071）

The fermentation process of DHA algae oil production by Crypthecodinium Cohnii was studied，based on Logistic equation and Luedeking-Piret equation.The biomass，the yield of oil and DHA and change of glucose concentration were determined using Crypthecodinium Cohnii in 50 L fermentation tank，based on which the kinetic models for thallus growth，oil production and substrate consumption were established，and the predictive values of models were compared with the experimental data，as a result，the average relative errors were less than 10%.Through the calculation of fermentation process curve fitting and model parameters，the related index of the model were 0.993，0.996 and 0.978，respectively，which showed they matched well.The result showed that the models could provide a reasonable description for the fermentation process of Crypthecodinium Cohnii，thus providing a theoretical basis for the industrial production of DHA.

Crypthecodinium cohnii，kinetic models，logistic equation，luedeking-piret equation

Q93-335

A

1003-0174（2016）09-0081-05

粮食公益性行业科研专项（201313012-03），十二五国家科技支撑计划（2011BAD02B00）

2015-01-04

王澍，男，1989年出生，硕士，微生物油脂

何东平，男，1957年出生，教授，粮食、油脂及植物蛋白