富含Gln小麦水解蛋白对DSS诱导小鼠结肠炎的作用研究

何林玲 王学东 李 丽 李 彪

富含Gln小麦水解蛋白对DSS诱导小鼠结肠炎的作用研究

何林玲1王学东1李 丽2李 彪3

（武汉轻工大学食品科学与工程学院1，武汉 430023）
（武昌工学院2，武汉 430065）
（安琪酵母股份有限公司3，宜昌 443000）

探讨了富含谷氨酰胺（Gln）小麦水解蛋白对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎的影响。将24只小鼠分为正常对照组（Ⅰ组）、DSS诱导模型组（Ⅱ组）和营养液组（Ⅲ组）。观察了临床表现及结肠黏膜的病理组织变化，检测了结肠组织的抗氧化活性，荧光定量PCR测定了结肠组织中炎症因子的表达。结果表明，营养液处理后，减轻了由结肠炎造成的结肠黏膜的病理损伤，结肠组织中的IFN-γ和IL-6的表达较模型组低，而IL-10和TGF-β的表达差异不显著，表明富含Gln的小麦水解蛋白可以促进促炎／抑炎因子的相对平衡，从而缓解肠道炎症，是一种潜在的抗氧化和抗炎资源。

谷氨酰胺 DSS 小鼠结肠炎 炎症因子

从氨基酸的组成来看，小麦蛋白中谷氨酸约占氨基酸总质量分数的35%，并且主要以谷氨酰胺（Gln）的形式存在，而Gln是动物血浆和组织中含量最丰富的游离氨基酸，约占总游离氨基酸的40% ～60%［1］。Gln是一种十分重要且具有特殊营养作用的条件性必需氨基酸及肠道必需氨基酸。可以促进肠黏膜细胞的增殖，维护肠黏膜的屏障，是肠道修复最重要的营养物质［2］。Gln同时可以调节免疫功能，参与机体免疫保护，无论口服或是静脉补充都有助于肠道炎症和黏膜损伤的改善，有利于肠道免疫功能的重建及细菌易位的发生［3］。Gln作为肠黏膜细胞合成的能源物质及形成紧密连接的大分子的必要成分，可降低肠上皮细胞通透性，保护应激时肠黏膜的屏障功能，另外还可以通过维持结肠黏膜形态及屏障功能的完整来提高机体的抗氧化能力，减缓炎症反应，从而使结肠炎造成的结肠黏膜损伤得到缓解［4］。有试验小组通过免疫组学的方法检测NF-κB的活性及HO-1的表达时发现：Gln可以减少结肠炎小鼠的肠道损伤，其保护机制是通过抗氧化、抗炎作用来阻碍NF-κB的激活，抑制MDA、蛋白酶3 及HO-1的表达［5］。

本试验通过DSS诱导小鼠结肠炎的产生，模拟人类结肠炎，探索富含Gln小麦水解蛋白在防治结肠炎方面的功效。初步阐明其抗肠炎的分子机理，为合理的膳食提供指导，进一步为功能性食品的开发提供参考，同时又最大限度地利用了小麦蛋白资源，减少浪费，为小麦深加工提供发展方向。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

6周龄ICR小鼠、基础饲料：湖北省实验动物研究中心［合格证号：NO.42000600005398，许可证号：SCXK（鄂）2008-0005］；富含谷氨酰胺小麦水解蛋白营养液（谷氨酰胺质量分数31.2%）：实验室自制；葡聚糖硫酸钠（DSS，Dextran Sulfate Sodium 5000）：MPBIO公司；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒A003-1、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒A006-2、丙二醛（MDA）试剂盒A003-1、髓过氧化物酶（MPO）试剂盒A044：南京建成生物工程研究所；WFG7200可见光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司；TDZ5-WS医用离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；qTOWER 2.0PCR仪：德国耶拿分析仪器股份公司。

1.2 小麦水解蛋白制备工艺流程

选用优质小麦面筋蛋白为原料，配成质量分数为4%的溶液，用双步酶解法（先用碱性蛋白酶再用复合蛋白酶，2种加酶量比为1∶2）酶解，在此过程温度控制为酶所需的最适温度，用0.1 mol／L NaOH或HCl调节体系pH为最适pH值，达到酶解终点时，95℃下灭酶15 min，在4 000 r／min下离心分离得到上清液，最后通过超滤纯化、悬蒸浓缩、冷冻干燥得到所需的小麦水解蛋白样品。

1.3 实验动物分组及动物模型的建立［6］

6周龄的ICR小鼠24只，体重（18±2）g，适应性饲养1周后开始试验。将小鼠随机分为3组（n＝8）：正常对照组、DSS模型组、小麦水解蛋白营养液组。Ⅰ组（正常对照组）：每日自由进饮用水及基础饲料，不做任何处理；Ⅱ组（DSS模型组）：每日自由饮用5%DSS溶液替代饮用水，自由进食基础饲料；Ⅲ组（小麦水解蛋白营养液组）：每日自由饮用5%DSS溶液替代饮用水，自由进食基础饲料，每日灌胃30%小麦水解蛋白营养液。正常对照组、DSS模型组每日予等量无菌蒸馏水灌胃，试验时间7 d。基础饲粮参照GB14924.1-200l实验动物配合饲料通用质量标准配合而成。实验室控制条件为恒温25℃，自然采光。

1.4 疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分

24 h后观察DSS模型组动物的行为变化及排便情况。待小鼠出现黏液稀便或血便时，便可初步确定模型建立成功。试验过程中每日观察小鼠的体重变化、大便性状，并且每日观察或用粪便隐血试纸检测大便带血情况。按DAI评分标准（表1）进行评分，将上述3项评分相加，得出每只小鼠的DAI评分。试验过程中同时对小鼠的其他一般情况进行观察，如懒动、体毛凌乱、精神状态、进食、饮水和活动情况等。

表1 DAI评分标准

1.5 样品的采集与处理

小鼠手术前禁食12 h，自由饮水。然后处死小鼠，沿腹中红线切开腹壁，暴露腹腔组织，小心分离结肠（从回盲部到肛口，切取结肠，沿肠系膜纵向剖开肠段，用冰生理盐水冲洗后，取部分结肠段进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、匀浆检测及荧光定量PCR检测。

1.6 观察指标与检测方法

1.6.1 组织学切片的制备及观察

小鼠处死后，迅速切取0.5 cm结肠段，固定于4%多聚甲醛溶液中，常温保存，常规石蜡包埋，切成8 mm厚的连续切片，进行HE染色，中性树胶封片。在光学显微镜下观察并拍照。

1.6.2 氧化指标的测定［7］

采用黄嘌呤氧化酶法进行超氧化物歧化酶（SOD）活力的测定；采用二硫代二硝基苯甲酸法进行还原型谷胱甘肽（GSH）含量的测定；采用改良硫代巴比妥酸法进行丙二醛（MDA）含量的测定；采用邻联二茴香胺氧化法进行髓过氧化物酶（MPO）活性的测定。

1.6.3 荧光定量PCR测定结肠中炎症细胞因子的表达［8］

小鼠处死后，迅速切取50 mg左右结肠段，保存在冷冻管中于-80℃保存待测，检测结肠组织中炎症细胞因子TGF-β、IFN-γ、IL-6、IL-10的表达情况。各基因引物信息如表2所示。

表2 基因的引物信息

1.7 数据处理

数据均采用均数±标准差（¯x±s）表示，采用Excel统计软件处理，多个样本的均数比较用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 小鼠结肠损伤的病理组织学观察结果

2.1.1 临床表现及剖检变化

小鼠在经DSS诱导后食欲骤减，毛色枯槁，神情倦怠，偶有扭体反应，并陆续出现稀便。灌服7 d后，Ⅰ组正常；Ⅱ组部分小鼠排黑色血便，肛门处有淡黄色脓惦物质渗出，且有死亡现象；Ⅲ组上述症状有所缓解。剖检发现Ⅰ组结肠黏膜完整，绒毛排列整齐，未见坏死、脱落；Ⅱ组大部分小鼠结肠壁显著的肿胀增厚，肠黏膜坏死、脱落，渗出物及肠内容物中混有血液；Ⅲ组上述症状减轻，其中Ⅲ组可见肠壁微肿胀，未见黏膜脱落和出血现象。通过对Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组小鼠的疾病活化指数进行评分，DAI评分值分别为：0.52±0.41、9.54 ±2.31、7.67 ±2.04、发现Ⅱ组小鼠DAI评分明显高于Ⅰ组、Ⅲ组（P＜0.01），小鼠发生炎症反应，造模成功。给予小鼠一段时间的营养液灌胃处理，DAI评分显著降低，小鼠结肠萎缩改善，结肠隐血、便血程度降低，炎症细胞侵润缓解，结肠炎症得到改善。疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分结果如图1。

图1 DSS诱导结肠炎DAI评分

2.1.2 病理组织学观察

光镜下观察发现对照组（Ⅰ组）结肠绒毛边缘整齐，致密，未见炎性细胞浸润，见图2a；模型组（Ⅱ组）结肠绒毛边缘疏松不整，结缔组织增生，且间质增宽，黏膜及黏膜下层大量炎性细胞浸润，黏膜上皮细胞中杯状细胞数量显著增多，见图2b；营养液组（Ⅲ组）肠黏膜结构清晰，黏膜上皮完整，炎性细胞浸润减少，见图2c。

图2 小鼠结肠组织病理切片图

2.2 小鼠结肠组织髓过氧化物酶活性（MPO）的检测结果

MPO主要存在于炎症细胞中，以中性粒细胞的细胞质中最为多见，它的活性反映了结肠组织中炎症细胞的浸润程度。与对照组相比，DSS模型组动物结肠组织MPO活性显著升高（P＜0.01），给予营养液后，Ⅲ组结肠组织MPO活性相对于模型组降低十分明显（P ＜0.01，图3）。

图3 各组小鼠结肠组织中MPO活性变化（¯x，n＝6）

2.3 小鼠结肠组织抗氧化功能指标的检测结果

SOD是自由基的天然清除剂，作为生物体细胞内的主要抗氧化酶，可以保护细胞免受损伤。与对照组相比，模型组小鼠结肠组织中SOD活性会明显降低（P＜0.01），营养液组小鼠的结肠组织SOD活性升高较为明显（P＜0.05，表3）

GSH是一种小分子肽，是由三个氨基酸组成的，它可以将体内有害的有毒的物质有效的转化为无害的物质，排出体外。通常被称作是机体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂。与对照组相比，模型组小鼠的结肠组织还原GSH含量明显降低（P＜0.01），营养液组GSH的含量相对于模型组来说升高较为明显（0.01＜P ＜0.05，表3）。

MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生能加剧膜的损伤，MDA含量的多少可以有效的显示出机体被自由基破坏的情况。与对照组相比，模型组小鼠结肠组织中MDA含量显著升高（P＜0.01），说明模型组小鼠结肠受到严重的损伤了，给予营养液后小鼠结肠炎中的MDA含量相对于模型组降低较为明显（P＜0.05，表3）。

表3 小鼠结肠组织抗氧化指标结果（¯x，n＝6）

2.4 结肠组织中炎症细胞因子的表达

2.4.1 RNA提取完整性分析

研究采用2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取质量。用DEPC处理过的超纯水配制的TAE缓冲液加入琼脂糖凝胶，每孔上样2.0μg总RNA样本，取琼脂糖凝胶EB染色，置于紫外灯下，观察结肠组织中总RNA在5s、18s和28s的核糖体RNA条带，可见清晰、明亮的18s、28sRNA条带。5s核糖体RNA的分子量比较低，当18s、28s的条带亮度高于5s的条带，则表明RNA样本为高质量的实验样品，如图4所示。

图4 2%琼脂糖凝胶电泳来评估结肠组织mRNA的完整性

2.4.2 结肠组织中TGF-β、IFN-γ、IL-6和IL-10基因表达

实时定量PCR分析对照组、模型组及营养液组的小鼠结肠组织IFN-γ表达水平相对值分别为：0.232±0.012、1.086±0.054、0.194±0.010。小鼠结肠组织IL-6表达水平相对值分别为：2.469±0.123、3.531 ±0.177、1.790 ±0.090。小鼠结肠组织IL-10表达水平相对值分别为：1.384±0.069、2.064±0.103、1.593±0.080。小鼠结肠组织TGF-β表达水平相对值分别为：1.685±0.084、2.167±0.108、1.965±0.098。采用2-ΔΔCT法进行分析，如图5所示，发现在正常机体内，IFN-γ和IL-6表达水平较低，DSS诱导后，小鼠体内的IFN-γ和IL-6的表达显著升高，说明IFN-γ和IL-6的表达与炎症反应有着密不可分的关系，炎症反应的发生机制及体内传导的信号通路与IFN-γ和IL-6有关。营养液处理后，小鼠体内的IFN-γ和IL-6的表达水平较DSS模型组降低，说明营养液可以通过控制IFN-γ和IL-6蛋白的表达，从而阻碍炎症反应发生的信号通路，从而防止炎症的产生。同时对抑炎因子IL-10及TGF-β进行研究，发现模型组中的表达均高于对照组，说明虽然结肠炎肠道炎症反馈反应导致抑炎因子表达升高，但仍然存在抑炎因子的相对不足，炎症／抑炎因子处于失衡状态。经营养液的干预后，炎症因子表达的减少反馈导致抑炎因子表达减少，从而缓解了炎症的发生。

图5 各细胞因子的表达水平

3 讨论

富含Gln小麦水解蛋白能够有效降低模型组小鼠的宏观炎症指标，降低DAI评分。对小鼠结肠组织切片进行HE染色，也观察到模型组小鼠结肠上皮黏膜糜烂，损伤严重，淋巴细胞及伴中性粒细胞等浸润，营养液组小鼠结肠损伤明显减轻，上皮结构相对完整，隐窝结构完整，排列比较整齐，炎症细胞浸润得到缓解。

对促炎因子IL-6及INF-γ研究，发现经富含Gln的小麦水解蛋白营养液的干预后，促炎因子表达明显下降，表明促炎因子下降是肠道炎症减轻的可能机制之一。同时对抑炎因子IL-10及TGF-β进行研究，发现模型组中的表达均高于对照组，与相关报道一致，说明虽然结肠炎肠道炎症反馈反应导致抑炎因子表达升高，但仍然存在抑炎因子的相对不足，使促炎／抑炎因子处于失衡状态［9］。经富含Gln的小麦水解蛋白营养液的干预后，炎症因子表达的减少反馈导致抑炎因子表达减少，并且与炎症减轻相一致。虽然细胞因子在结肠炎中的作用机制复杂，彼此间存在反馈与负反馈调节，构成了一个复杂的反应网络体系，但富含Gln的小麦水解蛋白可以抑制过度的免疫反应，减少细胞因子的过度表达，促进促炎／抑炎因子的相对平衡，从而缓解肠道炎症。

Gln作为肠黏膜细胞代谢活动的主要能源及核苷酸生物合成的主要氮源，可以降低断奶仔猪腹泻率［10］。Gln对于放射引起的大鼠黏膜损伤有保护作用，且可增加此时肠黏膜DNA、蛋白质的生物合成［11］。本试验发现营养液组小鼠结肠黏膜较模型组完整，提示Gln对于维持结肠炎所导致的黏膜结构受损具有保护作用，保护作用机理可能与Gln作用肠黏膜细胞的能源物质加快肠黏膜上皮细胞的更新，进而缓解炎症反应造成的黏膜结构损伤有关。Gln作为肠黏膜细胞合成的能源物质及形成紧密连接的大分子的必需成分，可降低肠上皮通透性，保护应激时肠的屏障功能。可以通过维持结肠黏膜形态及屏障功能的完整、提高机体的抗氧化能力、缓慢炎症反应来对结肠炎所致的结肠损伤起到修复作用，从而使结肠炎造成的结肠黏膜损伤得到缓解［12］。

4 结论

本研究表明富含谷氨酰胺的小麦水解蛋白对DSS诱导的小鼠结肠炎有显著的保护作用，营养液组的临床表现及结肠黏膜的病理组织变化都显著优于模型组，营养液组结肠组织中的抗氧化活性也明显增强，RT-PCR测定结肠组织中炎症因子的表达也显示富含Gln的小麦水解蛋白可以促进促炎／抑炎因子的相对平衡，从而缓解肠道炎症，是一种潜在的抗氧化和抗炎资源。

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Effect of Wheat Protein Hydrolysate with Rich Glutamine on Mucosal Barrier of DSSInduced Colitis Mice

He Linling1Wang Xuedong1Li Li2Li Biao3
（Food Science and Engineering College Wuhan Polytechnic University1，Wuhan 430023）
（Wuchang Institute of Technology2，Wuhan 430065）
（Angel Yeast Co.，Ltd3，Yichang 443000）

In order to explore the influence of wheat protein hydrolysate rich in glutamine（Gln）on dextran sodium sulfate （DSS）induced colitis in mice，using DSSinduced mice to establish the colitis model，after the completion of colitis model hydrolyzed wheat protein rich in nutrient solution Gln was irrigated for continuous7 d，and mice would be put to death.Through observing the clinical manifestations and pathological tissue changes of colonic mucosa，colon tissue myeloperoxidase（MPO），superoxide dismutase（SOD），reduced glutathione（GSH），and malondialdehyde （MDA）of activity were detected；using the fluorescent quantitative PCR to determine the expression of cell inflammatory factors in the colon tissues.The results showed that MPO activity and MDA content in colon tissue were reduced after affected by wheat protein hydrolysate nutrient solution，and SOD activity and GSH content were increased，reducing colonic mucosa pathological damage caused by colitis.The expression of inflammatory factors also shows that wheat protein hydrolysate nutrient solution rich in Gln had repairing functions on colon injuries of DSSinduced mice.

glutamine，DSS，mice colitis，Inflammatory factors

S-3

A

1003-0174（2016）09-0007-06

武汉轻工大学研究生教育创新计划（2013cx016）

2015-05-08

何林玲，女，1990年出生，硕士，食品科学

王学东，男，1979年出生，教授，食品科学