不同豆类对丛毛红曲菌MS-1发酵产物的影响

陈晓园 陈福生

不同豆类对丛毛红曲菌MS-1发酵产物的影响

陈晓园 陈福生

（华中农业大学食品科学技术学院，武汉 430070）

以黄豆、黑豆、豌豆、绿豆和红豆5种常见食用豆类为基质，以高产莫纳可林K（monacolin K）且不产桔霉素的丛毛红曲菌（Monascus pilosus）MS-1为发酵菌株，进行红曲菌固态发酵，并对红曲菌MS-1在不同豆类中的发酵进程、淀粉酶与蛋白酶的酶活、发酵产物色价、莫纳可林K的含量，以及色素组成进行了分析。结果显示，豌豆、绿豆、红豆比黄豆和黑豆更适合红曲菌的生长，发酵过程中淀粉酶与蛋白酶的产生、莫纳可林K和色素的积累，以及色素组分存在一定差异。其中，豌豆的色价和莫纳可林K含量最高，分别达到246.12 U／g（干基）和5.05 mg／g（干基），适合作为高色价和高莫纳可林K红曲的生产基质。

食用豆类 红曲菌 红曲色素 莫纳可林K 桔霉素

红曲通常是指以红曲菌，又称为红曲霉（Monascus spp.）为菌种，以米饭为培养基质的固态发酵产物。作为食品着色剂、防腐剂、发酵剂与中药配伍等在中国及东南亚地区有一千多年的应用历史［1-2］。

现代研究表明，红曲菌可以产生红曲色素（Monascus pigment）、降血脂成分莫纳可林K（monacolin K）和降血压成分γ-氨基丁酸等多种有益成分［3］，同时，部分菌株也可能同时分泌肾毒素——桔霉素（citrinin），从而污染红曲产品［4］。近年来，关于红曲产品研发、桔霉素控制、功能性成分发掘以及红曲菌分子生物学研究等已经成为红曲与红曲菌的研究热点［4-5］。

红曲通常是以早籼稻为原料生产的，早籼稻米饭具有疏松、不粘连、便于操作、通气性好等优点［1］。但早籼稻的组成成分相对比较单一，常常不利于提高红曲菌次生代谢产物，在米饭中补加一些营养成分，尤其是氮源可以明显提高红曲菌次生代谢产物的产量。例如，Jirasatid等［6］在米饭培养基中补加NaNO3后，莫纳可林K产量较不添加NaNO3提高了3倍，黄色素产量也较对照组提高了1.5倍；前期工作表明，在米粉中添加黄豆粉可显著提高莫纳可林K的产量［4］。寻找除稻米以外的其他原料作为基质生产红曲是提高红曲菌次生代谢产物产量的另一思路。例如，以山药（Dioscorea batatas）替代稻米培养红曲菌，可提高发酵产物莫纳可林K、黄色素和薯蓣皂苷元的产量，其中莫纳可林K和薯蓣皂苷元能有效防止由大鼠雌激素不足诱发的骨质流失［7］。此外，以高粱、米糠、麦麸、玉米和小米等替代稻米作为基质，也可以提高红曲菌发酵产莫纳可林K的产量［8-9］，但这些基质由于蛋白质含量较低，常需要额外添加氮源。食用豆类含有丰富的蛋白质和淀粉，适合作为红曲菌发酵基质，然而，目前以豆类为培养基生产红曲的研究很少，仅有以黄豆和黑豆作为基质生产红曲的报道，其他食用豆类作为红曲菌发酵基质鲜见报道［10］。

本研究以我国常见的食用豆类，黄豆、黑豆、豌豆、绿豆、红豆为原料，以实验室前期获得1株不产桔霉素的丛毛红曲菌（M.pilosus）MS-1 为菌种［4］，研究分析了这些豆类对红曲菌生长、蛋白酶和淀粉酶分泌、莫纳可林K产生以及红曲色价与色素组成成分的影响，以期得到高色价和高莫纳可林K红曲的生产基质。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：黄豆（Glycine max）、黑豆（G.max）、绿豆（Vigna radiata）、红豆（V.umbellata）均产自湖北省襄阳市，豌豆（Pisum sativum）产自内蒙古清水河县，大米（Oryza sativa）产自湖北省武汉市，含水量分别为13.1%、11.5%、12.1%、14.1%、12.8%、12.5%，淀粉质量分数分别为11.50%、8.0%、68.0%、56.3%、68.9%、78.5%，蛋白质质量分数分别为35.1% 、36.1% 、21.6% 、20.2% 、22.0% 、8.1% 。

菌株：丛毛红曲菌（M.pilosus）MS-1，本实验室保藏菌种，高产莫纳可林K，不产桔霉素［4］。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL，分装试管，121℃灭菌20 min后，制斜面。用于菌种保藏与活化。

种子液培养基：葡萄糖50 g，蛋白胨10 g，NH4H2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.1 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.0，分装至500 mL三角瓶，每瓶100 mL，121 ℃灭菌20 min。

豆类培养基：将豆类浸泡于蒸馏水中，25℃，24 h，去皮，分瓣，将豆瓣装入250 mL三角瓶中，每瓶50 g，121℃蒸煮20 min，趁热打散，备用。

1.2 仪器与试剂

Waterse2695型高效液相色谱仪：美国Waters公司；UV-1800型紫外分光光度计：日本Shimadzu公司；乙腈（色谱纯）：Fisher公司；莫纳可林K（洛伐他汀）：阿拉丁试剂有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 红曲菌种子液制备

丛毛红曲菌MS-1于PDA斜面活化后，用无菌水洗涤孢子，制成浓度为1.0×106个／mL的孢子悬液，取5 mL接种于种子液培养基中，30℃，120 r／min，培养48 h，备用。

1.3.2 不同豆类红曲的发酵进程分析

按10%（V／V）的接种量，将1.3.1制备的种子液接入豆类培养基中，30℃，培养15 d，每48 h打散摇匀1 次。分别于0、1、2、4、6、8、12、15 d 称重（WX），减去空三角瓶质量（W0），得到不同培养时间下培养基质量（W＝WX-W0），重复3次。以培养时间为横坐标，培养基质量W为纵坐标，绘制豆类红曲发酵进程曲线［11］。观察发酵过程中豆瓣外观和断面变化，拍照记录。

1.3.3 淀粉酶与蛋白酶活测定

1.3.3.1 酶液制备

按1.3.2 方法制备豆类红曲，分别于0、3、6、9、12、15 d，取0.2 g样品，加入5 mL pH 4.6的醋酸缓冲液研磨成匀浆后，40℃水浴2 h，滤液用于淀粉酶活力测定。同时，于上述培养时间，再分别取1.0 g样品各2份，分别加入10 mL pH 3.0乳酸钠缓冲液和pH 7.5的磷酸缓冲液研磨成匀浆后，40℃水浴2 h，滤液分别用于酸性和中性蛋白酶活力测定。

1.3.3.2 酶活的测定

淀粉酶活测定参照徐驰等［12］报道方法。酶活单位（U）：40 ℃，pH 4.6，l min分解可溶性淀粉产生1μg葡萄糖所需酶量。

蛋白酶活测定参照GB／T 23527—2009《蛋白酶制剂》福林法测定蛋白酶活［13］。酶活单位（U）：40℃，pH 3.0或7.5，1 min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需酶量。

1.3.4 色价、色素成分与莫纳可林K的测定

1.3.4.1 红曲提取液的制备

按1.3.2方法，接种培养15 d后，于40℃干燥约48 h至恒重，粉碎，过60目筛，得到豆类红曲粉。取0.1 g红曲粉，加入10 mL 70%乙醇，摇匀，60℃水浴2 h，10 000 r／min，离心10 min，上清液用于色价测定；取0.3 g红曲粉，加入2 mL甲醇，室温超声提取（2次，15 min／次），滤液用于色素成分分析；取0.3 g红曲粉，加入10 mL 75%乙醇，摇匀，室温下超声提取1 h后，10 000 r／min离心10 min，上清经0.45μm微孔滤膜后，滤液用于莫纳可林K含量测定。

1.3.4.2 色价测定

参照GB／T 15961—2005《食品添加剂红曲红》［14］中的方法测定色价。

1.3.4.3 色素成分分析

参照文献［15］报道方法进行色素成分分析。具体过程：将色素提取液点样于硅胶板，放入层析缸内，待展开剂前沿至15 cm处，取出，挥干溶剂，在自然光下观察。红色素和黄色素分别使用红色素展开剂和黄色素展开剂展开；橙色素先用黄色素展开剂展开后，将橙色色素条带的硅胶刮下，用乙酸乙酯溶解，适当浓缩后，再用红色素展开剂展开。红色素展开剂：甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸（7∶3∶1 V／V／V）；黄色素展开剂：正己烷∶乙酸乙酯∶石油醚（30∶17∶5 V／V／V）。

1.3.4.4 莫纳可林K测定

参照GB／T 2847—2007《功能性红曲米（粉）》［16］的测定方法。色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna 5u C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相∶乙腈∶水∶0.5% 磷酸（60∶37∶3 V／V／V）；检测器：紫外检测器，238 nm检测波长；流速1.0 mL／min；进样量20μL。以保留时间定性，外标法定量。

1.4 数据统计

所得数据均用SPSS 18.0软件进行统计分析，双侧t检验进行组间比较。

2 结果与分析

2.1 豆类红曲发酵进程分析

以黄豆、黑豆、豌豆、绿豆、红豆为原料，大米为对照，以高产莫纳可林K，不产桔霉素的丛毛红曲菌MS-1［4］为菌种，依照1.3.2方法进行发酵试验，分别测定不同培养时间的培养基质量。以培养时间为横坐标，培养基质量为纵坐标，绘制得到不同豆类红曲的发酵进程曲线（图1）。

图1 不同豆类的红曲发酵进程曲线

由图1可以看出，随着培养时间的延长，培养基的质量逐步减少。其中豌豆培养基质量减少最快，黑豆最慢。豌豆、红豆和绿豆在发酵前6 d质量下降较快，7～15 d下降趋于平缓。黄豆和黑豆在整个发酵过程中培养基减少均较平缓。图2是发酵前与发酵15 d后的豆瓣照片。

由图2可知，与发酵前相比，黄豆和黑豆15 d发酵后，豆瓣依然较为饱满，表面为暗红色或亮红色，豆瓣切面为红黄色；豌豆和绿豆颗粒干瘪，表面和切面均为深红色；红豆颗粒干瘪，表面为深红并略带黄色，切面为深红色。豆类干瘪程度与培养基质量减少的趋势一致（图1）。

图2 发酵前与发酵15 d后不同豆类红曲的照片

2.2 豆类红曲发酵过程中的酶活分析

为了探究不同豆类对红曲菌生长的影响，分析了发酵过程中红曲菌的主要水解酶——淀粉酶与蛋白酶的变化，结果见图3。

图3 不同发酵豆类淀粉酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶随时间变化曲线

图3可知，红曲菌MS-1在不同豆类上的产酶能力存在差异。

随着培养时间的延长，淀粉酶活力不断上升，15 d时达到最高。在发酵结束时（15 d），豌豆淀粉酶活力明显高于红豆、绿豆和黄豆，黑豆最低（P＜0.05）。

所有豆类红曲的中性蛋白酶活力均随着培养天数的增加呈现先上升后下降趋势。黄豆中性蛋白酶活在发酵6 d达到最大值，黑豆的酶活最大值出现在9 d，红豆、豌豆和绿豆最大值出现在发酵12 d。

红豆、豌豆和黑豆的酸性蛋白酶活力呈现先升高后降低趋势，绿豆和黄豆在发酵结束时酶活力最高。发酵结束时，豌豆、绿豆和红豆的酸性蛋白酶活力高于黄豆和黑豆（P＜0.05）。

前期预备试验表明，丛毛红曲菌MS-1不产生碱性蛋白酶，所以没有进行其酶活测定，这与前人的报道相同［17］。此外，中性和酸性蛋白酶活测定结果与前人报道的功能性红曲生产菌一致［17］。

2.3 豆类红曲色价、色素成分与莫纳可林K分析

色价是衡量红曲菌产色素能力的重要指标［17］。红曲色素通常包括红、橙和黄三大类色素成分［14］。研究表明，不同的菌种、培养基组成和培养条件等均可能影响红曲色素的组成［5］，为此本研究在测定不同豆类红曲色价的同时，还测定它们的色素成分差异。色价见表1，色素成分的薄层层析图见图4。

表1 豆类红曲色价和莫纳可林K的含量

由表1可知，豌豆、绿豆和红豆红曲的色价显著高于黄豆和黑豆，其中最高的豌豆红曲色价约为黑豆红曲色价的15倍，黄豆红曲色价的10倍。

图4 不同豆类色素薄层层析图

由图4可知，5种豆类红曲均有Rf值为0.19的红色素组分，豌豆和绿豆红曲红色素组分最多，均分离出Rf分别为0.08、0.19、0.27、0.30的4种组分，而黑豆红曲最少，仅1种红色素组分。黄豆和黑豆红曲中未分离出黄色素组分，豌豆、绿豆和红豆红曲中均存在Rf值为0.85和0.92的2种黄色素组分，其中红豆Rf值为0.92的黄色条带颜色较深。所有豆类红曲均未分离出橙色色素条带。

3 讨论

3.1 豆类成分差异影响红曲菌MS-1的生长发酵

研究结果表明：淀粉含量较高的豌豆、红豆和绿豆更适合于红曲菌生长、淀粉酶和蛋白酶分泌以及次生代谢产物（红曲色素和莫纳可林K）的合成。主要原因可能是：第一，红曲菌，包括本实验使用的丛毛红曲菌（M.pilosus）MS-1，是以富含淀粉的米饭为培养基筛选得到的，所以淀粉含量高（50%～70%）的豌豆、绿豆和红豆更适合其生长，而淀粉含量较低（＜20%）的黄豆与黑豆则相对不适宜；第二，不同豆类存在不同的碳氮比可能也是影响红曲菌MS-1生长与发酵的原因［4］；第三，豌豆、红豆和绿豆的凝胶能力高于黄豆和黑豆［18］，保水性较好，而高湿度有利于红曲菌生长繁殖［2］。这提示我们，当以不同的原料进行红曲生产时，选择合适的菌株，调整培养基的碳氮比，保持较高的湿度，消除培养基中抑制成分等对红曲菌发酵都是非常重要的。

对于均为高淀粉含量的豌豆、绿豆和红豆，豌豆的淀粉结晶度低且链长较长，经高温蒸煮冷却后淀粉的回生能力低于绿豆和红豆，淀粉分子更加分散，无定形区更多，而更多的无定形区更有利于淀粉酶水解［19］。所以豌豆淀粉有利于淀粉酶的水解，更容易被红曲菌利用。

3.2 不同豆类影响红曲色素成分

本研究的结果（图1和图4）还显示，豌豆能产生的红色素成分最多且色价最高，适合成为提高红曲色素产量的发酵基质。虽然红豆的红色素成分不及豌豆，但该基质发酵后期（8 d后）表面出现黄色（结果未显示）可能与薄层色谱中出现含量较高的黄色素成分有关（图4），有关原因有待于进一步分析。

4 结论

从发酵进程看，红曲菌在豌豆、红豆和绿豆培养基上生长良好且迅速，而在黄豆和黑豆培养基的整个发酵过程较缓慢。不同豆类红曲淀粉酶活力随培养时间延长而增加，发酵结束时的淀粉酶活力：豌豆＞红豆＞绿豆＞黄豆＞黑豆。蛋白酶活力方面，大部分豆类红曲呈现先上升后下降的趋势。在次级代谢产物中，无论色价还是莫纳可林K含量，豌豆、红豆和绿豆均明显高于黄豆和黑豆。

较高碳水化合物的豆类比含有较高蛋白豆类更适合红曲菌的生长、酶的产生和次级代谢产物的积累，而豌豆具有作为高色价和高莫纳可林K培养基质的潜力。

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The Effects of Different Edible Bean Varieties on Fermented Products of Monascus pilosus MS-1

Chen Xiaoyuan Chen Fusheng
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070）

In this paper，five commonly appeared edible beans，Glycine max （yellow soybean），G.max（black soybean），Pisum sativum，Vigna radiate，V.umbellate were used as substrates to prepare Hongqu in solidstate fermentation by Monascus.pilosus MS-1，which could not produce citrinin.Fermentation processes，enzymes activities，color values and functional secondary metabolites such as content of monacolin K and species of pigments were analyzed in different fermented beans.The results showed that P.sativum，V.radiate and V.umbellate were more beneficial to the growth of Monascus，enzyme activities，color values and concentration of monacolin K than G.max（yellow soybean and black soybean）as substrates.Besides，there were some differences among pigment constituents of these 5 fermented beans.Meanwhile Monascus-fermented P.sativum produced the highest amount of both color value and monacolin K among them，which were 246.12 U／g （dry-basis）and 5.05 mg／g （dry-basis），respectively.Using P.sativum as the media was recommended for the high yeild of monacolin K and color value.

edible bean，Monascus spp.，Monascus pigment，monacolin K，citrinin

TS214.9

A

1003-0174（2016）09-0026-06

2015-01-30

陈晓园，女，1991年出生，硕士，食品科学

陈福生，男，1965年出生，教授，食品安全与生物技术