复合酶对混合办公废纸的脱墨效果研究

訾连子，曹云峰*，丁少军

复合酶对混合办公废纸的脱墨效果研究

訾连子，曹云峰*，丁少军

（南京林业大学 江苏省制浆造纸科学与技术重点实验室，江苏 南京 210037）

分别用内切纤维素酶（EGI）和木聚糖酶（Xyn）复配得到的混合酶和由二者通过基因融合得到的融合酶，对混合办公废纸（MOW）进行脱墨。研究发现混合酶最佳处理条件为木聚糖酶与纤维素酶复配比例为2∶3（体积比）、pH7.0、酶处理时间60 min、脱墨温度55℃，融合酶最佳处理条件为酶用量0.6 IU/g、pH7.0、酶处理时间60 min、脱墨温度55℃。比较两种复合酶的脱墨效果发现，融合酶脱墨效果明显好于混合酶，融合酶脱墨纸页的白度明显高于混合酶，可以达到94.14% ISO，残余油墨量也较低，可以降为160 058（个/m2）。

混合办公废纸；融合酶；混合酶；脱墨

脱墨技术是废纸制脱墨浆的关键，研究人员在废旧新闻纸生物酶脱墨的基础上，将生物酶法应用于办公废纸的脱墨，并且取得了积极的实际效益[1]。

由于酶的专一性，一种酶只能作用于脱墨的某一点，因此采用两种或多种酶复配在一起进行脱墨，可以发挥各自的协同作用，加快废纸上油墨的脱除，有利于改善脱墨效果，提高脱墨浆白度。据文献报道，纤维素酶和木聚糖酶都是以改变油墨粒子附近的纤维表面或连接价键脱出油墨粒子来脱除油墨。在相同的酶用量下，纤维素酶的脱墨效果优于木聚糖酶，但对纤维的损伤程度往往大于木聚糖酶，对浆的强度不利；木聚糖酶脱墨效果稍差，但对强度的影响较小[2]。最佳方法是将这两种酶混合起来进行废纸脱墨，充分利用二者的互补作用和协同作用[1]。本文重点研究纤维素酶/木聚糖酶的混合酶以及二者的融合酶对混合办公废纸（MOW）脱墨效果的影响。

复合酶包括混合酶和融合酶。混合酶是由两种或两种以上单种酶以不同比例复配而得到。融合酶是指通过一定的手段将目标酶和另外一个或多个酶（或蛋白、短肽等）以一定的形式连接起来，从而获得的具有多种功能的酶。构建融合酶的最直接的优势之一是可以将多个蛋白功能集成于一体，实现酶的多功能化。融合酶的一个优势在于能够将多种酶催化活性整合在一个杂合蛋白上。通过融合蛋白技术将多个参与序列催化反应的酶连接，通过调控其空间靠近效应，控制反应效率。通过融合酶实现多种酶的空间靠近效应，从而大大加速了整个催化过程[3-4]。

本研究将来源于草菇的内切型纤维素酶与木聚糖酶做融合表达，得到木聚糖酶/纤维素酶的融合酶，这种融合酶是同时具有纤维素酶活性与半纤维素酶活性的双功能酶，这样融合酶在用量上就可以减少，并且酶活比单一酶都要高，从而降低生物酶的成本，提高酶促反应的作用效果。

1 实验

1.1 酶活测定

实验所用的木聚糖酶/纤维素酶的混合酶及二者融合酶由本校微生物实验室提供。

本实验中酶活测定采用Smogyi-Nelsonl方法（以纤维素酶酶活测定为例来说明）。

尼尔森试剂（Nelson Reagent）：含(NH4)6Mo24·4H2O 25 g、Na2HAsO4·7H2O 3 g、浓H2SO421 mL。总体积定容至500 mL。

索莫奇试剂（Somagyi Reagen）：含CuSO4·5H2O 4 g、Na2CO324 g、NaHCO316 g、C4O6H2KNa·4H2O 12 g、Na2SO4180 g。总体积定容至1 L。

1.5 mL反应体系中含1.0 mL pH7.5的0.1 mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液、0.4 mL 2% CMC-Na（底物）和0.1 mL分别稀释一定倍数的纤维素酶液。先将此1.5 mL反应体系置于50℃恒温水浴中加热30 min，然后向其中分别加入0.5 mL Somagyi Reagent试剂在100℃恒温水浴中煮沸15 min，然后取出来冷却至室温，向其中加入0.5 mL Nelson Reagent，静置20 min，再在离心机中以1 000 r/min离心10 min后，取200 μL上清液，在520 nm下测其吸光度值（A）。

测出来的吸光度值A要按照葡萄糖标准曲线查出对应的葡萄糖含量，然后按照如下计算公式算出纤维素酶酶活（CMCase）。

葡萄糖的标准曲线方程：y＝－0.066 4+0.009 8 x，R2＝0.999 74。

其中x为葡萄糖浓度（μg/mL），y为520 nm处的吸光值。

酶活力计算公式如式（1）所示[5]。

式中，A为最终吸光值（A），N为酶液的稀释倍数，t为酶促反应时间（30 min），C为所加酶液的量（0.1 mL），M为葡萄糖的摩尔质量（180 g/mol）。

木聚糖酶酶活的测定与纤维素酶酶活的测定过程相同。但所用的缓冲液为pH7.0的柠檬酸缓冲液，降解的底物为0.5%的榉木木聚糖（Beechwood）。反应生成的木糖量可根据木聚糖标准曲线查出。按式（2）计算木聚糖酶酶活。

1.2 酶法脱墨

1.2.1 酶处理

原料为混合办公废纸（MOW），用ZQS2型打浆机打浆后，离心甩干，并分散均匀，浆料装入塑料袋中平衡水分2～3天。称取10 g绝干浆于塑料袋中，加入酶、缓冲液和水，使浓度为10%，并将塑料袋放入恒温水浴中，每隔几分钟搓揉一次，使之充分混合均匀，酶处理完成后将其放入100℃水浴中将酶灭活。

1.2.2 浮选

将酶处理后的废纸浆加水稀释到浓度为1%，同时，加入相当于绝干浆0.2%的表面活性剂OP-10（辛基酚聚氧乙烯醚），用自制浮选器浮选15 min；将浮选后的浆料浓缩、分散，并将浆料装入塑料袋中平衡水分2～3天，留作抄纸用。

1.2.3 抄纸、纸性测定

将浮选后的废纸浆用ZQJ 1-B型抄纸机进行抄片，定量为60 g/m2，然后用白度测定仪（YQ-Z-48A）测纸页白度，Auto-spec尘埃度仪（Dan Bell公司）扫描测定油墨量。

2 结果与讨论

2.1 酶用量的影响

2.1.1 混合酶用于MOW脱墨

由于作用机理的差别，木聚糖酶和纤维素酶用于脱墨各有利弊，不同的酶有不同的作用特点[6-7]。有研究表明，在相同的酶用量下，纤维素酶的脱墨效果优于木聚糖酶，但纤维素酶会导致纸浆中纤维的降解，影响脱墨后纸浆的强度，木聚糖酶脱墨效果稍差但强度所受影响较小[8]。为了得到白度、强度俱佳的脱墨浆料，需要进一步研究两种酶混合脱墨的效果。

控制酶总量为1 IU/g（对绝干浆），设定木聚糖酶与纤维素酶复配比例（体积比）分别为5∶0、4∶1、3∶2、2∶3和1∶4，对应图1中Xyn/EGI的比例编号分别为1、2、3、4和5，脱墨浓度10%，脱墨温度45℃，pH值为7.0，脱墨时间45 min。实验结果如图1所示。

由图1发现，在木聚糖酶与纤维素酶复配比例为2∶3时，抄成纸页的白度最高，油墨点数最少，所以脱墨效果最好。在达到最佳复配比例之前随着纤维素酶所占比例增加，脱墨后纸张白度逐渐升高，油墨点数逐渐减少，但达到最佳复配比例后，随纤维素酶比例继续增加，脱墨效果反而变差。所以，木聚糖酶与纤维素酶适宜的复配比例为2∶3。

图1 混合酶在Xyn/EGI不同复配比例下脱墨效果

图2 融合酶在不同酶用量下脱墨效果

2.1.2 融合酶用于MOW脱墨

融合酶在顺序催化过程中比组成它的各种单一酶在催化速度上都有优越性[9-10]，因此本文设计出具有双重功能的纤维素酶/木聚糖酶融合酶以提高酶脱墨的效率。本研究以来源于草菇中的纤维素酶（EGI）以及木聚糖酶（Xyn）基因为融合对象，采用酶连法，从而使得所构建的杂合酶既具有纤维素酶活性又具有木聚糖酶活性，在降解天然底物的时候更经济有效。

融合酶用量分别为0.0、0.3、0.6、0.9和1.2 IU/g（对绝干浆），脱墨浓度10%，脱墨温度45℃，脱墨pH值为7.0，脱墨时间45 min。实验结果如图2所示。

由图2可见，适当提高融合酶的用量有助于提高脱墨浆的白度，但酶用量过高，抄成纸页的白度出现下降趋势，残余油墨点数也出现上升趋势，脱墨效果下降。这可能是因为酶用量过高，酶对废纸浆的作用过于强烈，导致油墨粒子过度分散而变得细小，浮选时细小的油墨粒子容易被纤维“回吸”，因而脱墨效果下降，而且生产成本也会随着酶用量的增大而提高；可见，融合酶用量在0.6 IU/g时脱墨后纸的白度最高，油墨点数最少，所以此时脱墨效果最好。

2.2 脱墨其它因素的影响

在纤维素酶和木聚糖酶各自的最佳酶用量以及混合酶最佳复配比例下，探讨三种酶各自的最佳脱墨pH、脱墨温度和脱墨时间。

2.2.1 脱墨pH对两种酶脱墨效果的影响

在各自最佳酶用量下，脱墨pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，脱墨浓度10%，脱墨温度45℃，脱墨时间45 min。实验结果如图3、图4所示。

图3 pH对两种酶脱墨后纸页白度影响

图4 pH对两种酶脱墨后纸页残余油墨点数影响

由图3可见融合酶白度较高，在pH为7.0时最高白度可以达到93.57%ISO，且由图3可见在pH为7.0时两种酶都可以达到最高白度，为最佳脱墨pH。由图4可见融合酶脱墨后抄成纸页油墨点数较少，且在pH为7.0时最少；混合酶脱墨后纸页残余油墨点数较多，在pH为7.5时油墨点数最少，但其随pH变化不明显，由于混合酶在pH为7.0时白度明显最高，所以混合酶在pH为7.0时脱墨效果最好。

对pH值的研究表明，中性条件下比较有利于酶促反应的发生，而过高或过低都会降低相对酶活力，从而影响脱墨效果，一般控制pH在6.5～7.5为宜。在这个范围内能够获得较理想的脱墨效果。

2.2.2 脱墨温度对两种酶脱墨效果的影响

在各自最佳酶用量下，脱墨温度分别为40、45、50、55和60℃，脱墨浓度10%，pH值为7.0，脱墨时间45 min。实验结果如图5、图6所示。

由图5可见，融合酶脱墨后纸页白度高，且在55℃时达到最高白度94.14%ISO，在50℃左右油墨点数最少；由图6可见，融合酶脱墨后纸页残余油墨点数最少，最低只有181 996（个/m2），这与它们白度随温度变化趋势一致。

一般最佳脱墨温度控制在45～55℃为宜，温度对酶的作用有两面性，它既可以加速酶的催化反应，也可以引起酶的失活。

图5 温度对两种酶脱墨后纸页白度影响

图6 脱墨温度对两种酶脱墨后纸页残余油墨点数影响

2.2.3 脱墨时间对两种酶脱墨效果的影响

在各自最佳酶用量下，脱墨时间分别为15、30、45、60和75min，脱墨浓度10%，pH值为7.0，脱墨温度45℃。实验结果如图7、图8所示。

图7 脱墨时间对两种酶脱墨后纸页白度影响

图8 脱墨时间对两种酶脱墨后纸页残余油墨点数影响

由图7可见融合酶脱墨后纸页白度都很高，在60 min时，白度达到最高，可达93.33%ISO；由图8可见融合酶脱墨后纸页残余油墨点数较少，且在60 min时脱墨后抄成纸页残余油墨点数最低，可降为160 058（个/m2）；混合酶脱墨后纸页残余油墨量较高，且随脱墨时间变化不明显。

综上可知，混合酶最佳脱墨条件为木聚糖酶与纤维素酶复配比例为2∶3，pH值7.0，温度在55℃，酶处理时间在60 min。融合酶脱墨效果明显好于混合酶，融合酶最佳脱墨条件为酶用量0.6 IU/g，pH值为7.0，酶处理温度为55℃，酶处理时间为60 min。

3 结论

1）由于生物酶法脱墨比传统化学法脱墨具有对水体污染较小等优点，通过纤维素酶/木聚糖酶混合酶及二者融合酶对混合办公废纸脱墨研究发现，融合酶脱墨效果明显好于混合酶，其最佳工艺条件为：纸浆浓度10%，酶用量为0.6 IU/g（对绝干浆）在pH为7的中性条件下，脱墨时间60 min左右，反应温度在55℃左右可获得比较好的脱墨效果。

2）实验发现纤维素酶与木聚糖酶通过基因融合方式得到的融合酶的脱墨效果明显好于混合酶，其中融合酶在最佳条件下脱墨，脱墨后抄成纸页的白度可以达到94.14%ISO，残余油墨量最低为160 058（个/m2）。混合酶脱墨浆最高白度为93.33%ISO，残余油墨量最低为188 376（个/m2）。

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Study on the Effect of Fusion Enzyme Used for MOW Deinking

ZI Lian-zi, CAO Yun-feng*, DING Shao-jun
（Jiangsu Provincial Key Laboratory of Pulp and Paper Science and Technology, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China）

In this study, mixed enzyme of cellulose and xylanase and the fusion enzyme of cellulose and xylanase obtained by gene fusion were respectively used for mixed office waste (MOW) deinking. The whiteness and residual ink points of the paper made were tested to compare their deinking effect. The study found that the best treatment conditions of mixed enzyme were that the ratio of xylanase with cellulase was 2∶3, the best processing conditions of fusion enzyme was 0.6 IU/g for dosage. Both these two enzymes had best deinking effect at pH7.0, enzymatic treatment time 60 min, deinking temperature 55℃. The study found that the effect of fusion enzyme deinking was better than the mixed enzyme deinking. The brightness of the paper after fusion enzyme deinking was obviously higher than mixed enzyme deinking, residual ink points of the paper after fusion enzyme deinking also decreased. The whiteness of the paper after fusion enzyme deinking could reach 94.14%ISO and its residual ink point was the lowest, to 160 058 (Number/m2).

MOW; fusion enzyme; mixed enzyme; deinking

TS749.7

A

1004-8405(2015)02-0013-06

2015-03-10

国家自然科学基金（31270628）；江苏省高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）。

訾连子（1989～），女，硕士研究生；研究方向：制浆造纸工程。1093715368@qq.com

* 通讯作者：曹云峰，教授，博士，博士生导师；研究方向：制浆造纸与清洁生产。yunfcao@163.com