纤维素酶高效水解麦秆的工艺研究

肖玲玲，汤金婷，龚大春

纤维素酶高效水解麦秆的工艺研究

肖玲玲1，汤金婷2，龚大春2

（1. 湖北三峡职业技术学院，湖北 宜昌 443002；2. 三峡大学，湖北 宜昌 443002）

以纤维素酶水解蒸汽爆破麦秆的过程为研究对象，考察了底物浓度、纤维素酶用量、β-葡萄糖苷酶装载量以及化学激活剂对麦秆水解的影响。结果表明，高底物浓度下的最佳酶解工艺条件为底物（麦秆）浓度20%，酶装载量（U/g纤维素）：滤纸酶活45、β-葡萄糖苷酶25、木聚糖酶800，0.1 mmol/L Mg2+、0.1 mmol/L Co2+、10 mmol/L Fe3+，1 g/L PEG2000、1 g/L Tween80和1 g/L山梨醇，搅拌速度120～150 r/min，分批补料，pH4.8，50℃，水解时间144 h。在此条件下，还原糖浓度达115.43 g/L，葡萄糖浓度达88.39 g/L，转化率也分别达到78.04%和88.73%。

气爆麦秆；纤维素酶；高效水解

随着不可再生能源的日趋枯竭，可再生能源的开发利用迅速崛起。其中，利用木质纤维素可再生生物质为原料生产燃料乙醇工艺的研究，已成为当前各国研究的重点。纤维素乙醇的核心技术包括原料预处理、纤维素水解、酒精发酵及后处理[1-3]。其中纤维素水解为可发酵糖是纤维素乙醇炼制过程中至关重要的环节。

纤维素水解反应为非均相反应，因此，酶与底物的有效吸附量是控制水解速率、产率的重要因素。低底物浓度下的糖化，由于酶与底物的充分接触，酶能及时从底物作用位点上解吸，重新开始与新的位点结合，有效地发挥催化作用，水解率能够达到90%以上[4]。但是，低底物浓度时，得到的产物浓度偏低，不利于后期发酵及产物提纯，因此提高单位体积中可发酵糖浓度势在必行。

本文通过改变底物（气爆麦秆）浓度、改善传质、调整酶系组成、利用化学激活剂调控等手段对纤维素酶解过程进行了优化，得出最佳酶解工艺条件，以期为木质纤维素的高效利用提供理论依据与技术参考。

1 实验

1.1 材料

蒸汽爆破处理后的麦秆，安琪酵母股份有限公司提供；纤维素酶ZSS-600，山东泽生生物科技有限公司；木聚糖酶，山东泽生生物科技有限公司；黑曲霉酶液，三峡大学艾伦·麦克德尔米德再生能源研究所提供[5]。

1.2 实验方法

取经过蒸汽爆破处理后的麦秆，通过添加不同浓度的纤维素酶、β-葡萄糖苷酶及化学激活剂，于50℃、pH4.8的条件下进行水解，水解到预定时间后，测定水解液中还原糖浓度、葡萄糖浓度，计算还原糖转化率和葡萄糖转化率。

1.3 分析方法

1.3.1 纤维素酶酶活测定

将酶液或固态酶稀释一定倍数后，吸取0.5 mL，加入相应底物及缓冲液，混匀，置于50℃水浴中反应30 min后，迅速加入DNS试剂1.0 mL，沸水浴中加热10 min，取出在540 nm波长下测OD值，通过线性回归方程求出还原糖的含量。酶活定义：在50℃、pH4.8的条件下，每分钟从底物中释放1 μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。

1.3.2 还原糖含量的测定

采用DNS法测定。

2 结果与讨论

2.1 底物浓度对纤维素酶解的影响

酶装载量（U/g纤维素）：β-葡萄糖苷酶60，滤纸酶活60，木聚糖酶800；pH4.8，50℃条件下，水解144 h，研究不同底物浓度对纤维素酶解的影响。结果如图1所示。

由图1可知，底物浓度大于5%时，传质受阻，糖浓度反而降低，转化率也急剧下降，底物浓度为10%时，还原糖转化率降至26.19%，葡萄糖转化率仅为39.1%。分析原因可能是底物浓度的增加导致传质受阻，底物与酶的接触机会反而减少，有效结合几率降低，限制了酶的催化作用。

图1 底物浓度对纤维素酶解的影响

图2 底物浓度对纤维素酶解的影响

为了改善传质，在此基础上，进行了两点调整：1）增加机械搅拌，转速控制在120～150 r/min；2）采用分批补料，为了保证后期加入的底物能充分水解，所以要求底物在48 h内补完。调整后，酶解结果如图2所示。

由图2可看出，适当的搅拌和分批补料条件下，底物浓度增至20%前，糖浓度随底物浓度的增加而明显增大，还原糖浓度最大达到115.12 g/L，葡萄糖浓度达到87.62 g/L，转化率也分别稳定在70%和85%以上。再增加底物浓度，糖浓度反而下降。分析原因：一方面固态物含量过高，反应体系的流变性降低，不利于酶解[6]；另一方面，底物浓度增加，底物抑制和产物抑制加剧，尤其是底物中呋喃、酚酸类等物质对酶有强烈的抑制作用[7]，产物纤维二糖对内切酶、外切酶的阻遏作用也较明显。

2.2 纤维素酶装载量对纤维素酶解的影响

酶装载量（U/g纤维素）：滤纸酶活30～50，β-葡萄糖苷酶15，木聚糖酶800；pH4.8，50℃条件下，水解144 h，研究纤维素酶装载量对纤维素酶解影响。结果如图3所示。

由图3可知，还原糖含量随纤维素酶量的增加而增加，到滤纸酶活为45 U/g纤维素时，还原糖浓度为105.98 g/L，转化率达到71.61%，葡萄糖浓度此时已达到最大87.00 g/L，转化率为82.66%，此后继续加大酶量，还原糖浓度增加，但葡萄糖浓度基本不变。结果显示在酶未饱和前，葡萄糖浓度已经达到最大，分析原因可能是由于添加的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶量的不足，而导致水解后的纤维二糖、纤维三糖等无法及时的转化为葡萄糖。综合考虑，确定纤维素酶滤纸酶活为45 U/g纤维素。

图3 纤维素酶装载量对纤维素酶解的影响

图4 β-葡萄糖苷酶装载量对纤维素酶水解的影响

2.3 β-葡萄糖苷酶装载量对纤维素酶解的影响

酶装载量（U/g纤维素）：滤纸酶活45，β-葡萄糖苷酶10～35，木聚糖酶800；pH4.8，50℃条件下，水解144 h，研究β-葡萄糖苷酶装载量对纤维素酶解影响。结果如图4所示。

图4表明，增加β-葡萄糖苷酶酶活，能促进纤维素酶解，葡萄糖浓度增幅较大，还原糖在β-葡萄糖苷酶酶活装载量低于20 U/g纤维素时，增幅不大，在25 U/g纤维素时，可能由于纤维二糖即时水解为葡萄糖，其反馈抑制减弱，还原糖浓度也随之提高，此时，还原糖和葡萄糖浓度都达到最大，分别为99.61和79 g/L。图中出现的糖随β-葡萄糖苷酶酶活升高而降低的现象可能是：为了提高β-葡萄糖苷酶酶活而对黑曲霉酶液进行了一定程度的浓缩，导致其流动性降低，粘性增加，从而减少了酶与底物的有效碰触。

2.4 化学激活剂对纤维素酶解的影响

高底物浓度下，纤维素完全水解需要纤维素酶不断进行有效的吸附及解吸附，并保证足够的酶解活力。然而在酶解过程中，底物抑制的增加，机械搅拌的剪切，底物表面的不可逆吸附等都会使酶失活。因此，寻找合适的化学激活剂（如金属离子、表面活性剂等），改善酶与底物结构和作用环境，激活酶的功能基团，保持酶的稳定性将有利于纤维素的高效酶解。

2.4.1 金属离子对纤维素酶解的影响

多数人认为金属离子能够和底物、酶等作用，改变底物或酶的结构，促进或抑制酶解。本文对几种常见的金属离子进行了考察，表1所示为添加不同金属离子（浓度分别为10、100 μmol/L）时，对应酶解所得的还原糖浓度。

表1 金属离子对纤维素酶解影响

由1表可见，Mg2+、Fe2+、Fe3+、Co2+对酶水解有一定的促进作用，对这几种离子进行了进一步优化，结果如图5所示。

图5显示，Co2+，Mg2+在低浓度（＜1 mmol/L）时激活作用明显，分别在0.01、0.1 mmol/L时，还原糖浓度达到最大，分别为105.38、107.01 g/L。Fe3+激活作用随离子浓度增加而增大，10 mmol/L时激活作用最明显。Fe2+激活作用不明显，甚至出现抑制。

图5 金属离子对纤维素酶解的影响

图6 表面活性剂类对纤维素酶解的影响

2.4.2 表面活性剂类物质对纤维素酶解的影响

研究表明添加表面活性剂有助于纤维素酶的解吸附，表面活性剂一方面制造了亲水环境，对酶在纤维素官能团上的解吸起到了重要作用[8]。另一方面通过减少内切葡聚糖酶的无效吸附，使游离的内切葡聚糖酶为外切酶提供更多的游离末端，促进纤维素的降解。本文考察了聚乙二醇（PEG）2000、油酸、山梨醇、Tween80、十二烷基磺酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等表面活性剂对纤维素酶解的影响，结果如图6所示。

结果表明，阴离子表面活性剂SDS和阳离子表面活性剂CTAB对纤维素酶水解都有抑制作用，而非离子表面活性剂PEG2000、油酸、Tween80、山梨醇对纤维素酶水解有不同程度的促进作用，其中1 g/L Tween80、10 g/L PEG2000、1 g/L山梨醇作用最明显，还原糖浓度分别增加19.06、13.65和9.96 g/L。当表面活性剂的浓度超过临界浓度则表面活性剂可能与酶蛋白结合在一起，或是过多的表面活性剂自聚成胶束，阻止酶与底物的接触而抑制酶作用。

2.5 条件优化后纤维素酶解

对纤维素浓度、传质、酶组分及装载量以及化学激活剂等的优化，最终得出的优化条件为：底物浓度20%，100 mL黑曲霉液，补加纤维素酶、木聚糖酶至酶装载量（U/g纤维素）：滤纸酶活45，β-葡萄糖苷酶25，木聚糖酶800，0.1 mmol/L Mg2+、0.1 mmol/L Co2+、10 mmol/L Fe3+，10 g/L PEG2000、1 g/L Tween80和1 g/L山梨醇，搅拌速度120～150 r/min，分批补料，pH4.8，50℃，水解时间144 h。在此条件下水解结果如表2所示。

表2 优化后条件下纤维素酶解结果

3 结论

本文确定了高底物浓度下纤维素酶解过程，最终确定酶解工艺条件为：250 mL锥形瓶装液量100 mL，底物SEWS浓度20%，酶装载量(U/g纤维素)：滤纸酶活45，β-葡萄糖苷酶25，木聚糖酶800，0.1 mmol/L Mg2+、0.1 mmol/L Co2+、10 mmol/L Fe3+，1 g/L PEG2000、1 g/L Tween80和1 g/L山梨醇，搅拌速度120～150 r/min，分批补料，pH4.8，50℃，水解时间144 h，在此条件下，还原糖浓度达115.43 g/L，葡萄糖浓度达88.39 g/L，转化率也分别达到78.04%和88.73%，为后期发酵得到较高的酒精浓度提供了较好的条件。

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Study on the Process of Cellulase Hydrolysis of Straw

XIAO Ling-ling1, TANG Jin-ting2, GONG Da-chun2
（1. Hubei Three Gorges Polytechnic, Yichang 443002, China; 2. Three Gorges University, Yichang 443002, China）

The cellulase hydrolysis process of steam explosion of straw as the research object was studied, the substrate concentration, dosage of cellulase, beta glycosidase enzymes loading capacity and the influence of chemical activator on straw hydrolysis. Results showed that high concentration of substrate optimum enzyme hydrolysis conditions for the substrate (straw) concentration 20%, enzyme loading capacity (U/g cellulase) : 45 filter paper enzyme activity, 25 β-Glucosidases activity, 800 xylanase activity, 0.1 mmol/L Mg2+, 0.1 mmol/L Co2+, 10 mmol/L Fe3+, 1 g/L PEG2000, 1 g/L Tween80 and 1 g/L sorbitol, the agitation speed 120～150 r/min, and fed batch cultivation at pH4.8, 50℃ for 144 h. On this condition, the concentrations of the reducing sugar and glucose were achieved 115.43 g/L and 88.39 g/L respectively, the conversations were 78.04% and 88.73% respectively.

gas detonation straw; cellulase; efficient hydrolysis

TQ353

A

1004-8405(2015)02-0008-06

2015-03-20

肖玲玲（1983～），女，湖南常德人，讲师，硕士，研究方向：生物化工。xll_tgc@163.com