产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件优化

张丽影，汪寒寒，潘 婷，邢承华*，蔡妙珍

产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件优化

张丽影1，汪寒寒2，潘 婷2，邢承华3*，蔡妙珍2

（1. 浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004；2. 浙江师范大学 地理与环境科学学院，浙江 金华 321004；3. 金华职业技术学院 农业与生物工程学院，浙江 金华 321007）

以羧甲基纤维素钠培养基和液体发酵培养基筛选菌株，经初筛和复筛筛选出目的菌株后，通过观察菌落形态、颜色和孢子形态等方法初步鉴定目的菌株。结果表明，本研究筛选出的2株目的菌株均为黑曲霉。菌株的最佳碳源和氮源分别为1.0%CMC-Na和0.3%酵母膏，最佳培养起始pH值和最适宜温度分别为4和40℃。在此条件下培养7d后菌株1和菌株2的CMCase酶活分别达到0.504 IU/mL和0.277 IU/mL。

产纤维素酶菌；筛选；羧甲基纤维素酶；酶活力

纤维素是地球中最丰富、来源最广泛的碳水化合物，它的降解与循环利用是实现碳循环的重要途径[1]。近年来，由于持续的能量耗损，枯竭的化石燃料与环境污染的加重，使得人们越来越关注碳资源的利用[2]。因此，纤维素的降解利用引起高度关注与重视。目前，纤维素一般用作燃料，或是被烧荒、遗弃腐烂掉，这不仅浪费了资源，还会引起严重的环境污染[3-4]。所以，纤维素的综合利用与有效的转化对于解决当前的能源危机、粮食短缺、环境污染等有重大的意义。

纤维素酶（cellulase）是降解纤维素的一组酶系总称[5]，它能将纤维素分解为葡萄糖，在食品、造纸、纺织、洗涤和饲料等工业有重要作用[6-9]。而降低纤维素酶的生产成本是纤维素酶真正用于工业生产的首要条件。因此，选育高酶活的纤维素分解菌株就成了关键之一。目前，大多数的商业纤维素酶都是由木霉属和曲霉属菌株生产得到的[10-11]。已有报道研究筛选产纤维素酶菌株，使经过微生物处理的玉米秸秆等转化为动物易吸收或利用的能源、物、料或化工原料，以实现纤维素的合理应用[12-13]。近年来，国内外对于产纤维素酶菌株筛选的报导虽较多，但大部分研究集中在对秸秆的降解上[14−16]，而且多数试验均采用单一的菌株对秸秆进行降解，降解效果不佳[17]。本文从长期栽培水稻的土壤中分离出产纤维素酶菌株，测定了纤维素酶活力并对其进行产纤维素酶条件优化，最大程度的增大菌株的产酶量及菌株的酶活力，利用优化的菌株共同处理平菇菌糠及杏鲍菇菌糠，以便降解菌糠中的粗纤维成分，使菌糠转化成利于动物消化和吸收的菌糠饲料。

1 实验

1.1 试剂与材料

菌种来源：从浙江师范大学生物园栽培水稻半年以上的土壤中，采集距地面约5～25 cm深处的土样，从中分离筛选产纤维素酶菌株。

初筛培养基：孟加拉红琼脂培养基[18]、羧甲基纤维素钠培养基（CMC-Na）[19]。

斜面培养基：PDA完全培养基[18]。

液体发酵培养基[4]：蛋白胨3 g，NH4NO32 g，酵母粉 0.5 g，KH2PO44 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，CMC-Na 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0～7.4。

初步鉴定培养基：察氏培养基[18]。

1.2 菌株的筛选

将采集的土样置于生理盐水中震荡，以制备菌悬液。取0.1 mL悬浮液涂布于孟加拉红培养基中培养，分别挑取生长不同的菌落划线分离接种于以CMC-Na为唯一碳源的CMC培养基中，直至分离得到纯菌株，采用刚果红染色法观察纯菌落的透明圈直径[20]，筛选出透明圈直径最大的菌株，即初步断定具有纤维素降解活性。将初筛得到的菌株接入到PDA斜面培养基上培养3～4 d后，加入无菌蒸馏水将斜面上孢子洗下并经过适当稀释制成孢子悬浮液（活菌数106CFU/mL）。以3%（V/V）的量将孢子悬浮液接入液体发酵培养基，测定酶活力，筛选出纤维素酶高产菌株。

1.3 羧甲基纤维素酶（CMCase）活力的测定及菌株产酶条件的优化

1.3.1 CMCase活力的测定

培养5～7 d的复筛发酵液，经4℃，3 000 r/min离心15 min后得到粗酶液[21]。采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法[22]，通过测经粗酶液反应后所得的葡萄糖含量来测菌株CMCase活性[23]。

按照上述条件，以国际单位为依据，定义1 min催化纤维素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位（IU），其计算公式如式（1）所示[24]。

1.3.2 菌株产CMCase条件的优化

分别对菌株1和菌株2进行产酶条件的优化，优化指标包括碳源、氮源、培养基起始pH、培养温度和培养时间（如表1所示）。通过检测菌株的CMCase活力确定菌株产酶的最佳条件。

表1 菌株的优化条件

1.4 数据处理

各实验重复3次，根据3次实验所得数据计算平均值和标准误差，利用EXCEL2003进行数据统计，用SPSS.17软件进行方差分析。

1.5 菌株的初步鉴定

将菌株1和菌株2分别接种到察氏培养基中，于28℃培养2～3 d后，初步肉眼观察菌落大小、形状、颜色；然后利用水浸片法，取干净载玻片，加无菌水一滴，用接种环挑取少量菌体放入无菌水中，盖好盖玻片，显微镜下观察菌株的菌丝及孢子形态。根据真菌分类鉴定手册对菌株进行初步鉴定[25]。

2 结果与讨论

2.1 产纤维素酶菌株的筛选、初步鉴定和活性比较

由图1可见，分离得到的菌株接种到CMC-Na固体培养基培养2～3 d后，经刚果红染色可以看到明显、稳定的透明圈，菌株1的菌落直径（d1）是2.142 cm，透明圈直径（D1）是4.598 cm，D1/d1是2.147；菌株2的菌落透明圈直径（d2）是2.7 cm，透明圈直径（D2）是2.774 cm，D2/d2是1.027。经液体发酵后，菌株1和菌株2的CMCase活力分别是0.214 IU/mL和0.188 IU/mL，其中菌株1比活力比菌株2的CMCase活力高出14.2%。此后菌株采用察氏培养基培养，两种菌株的菌落质地呈丝绒状，颜色呈黑褐色，后呈不同程度的黄色。菌株1的菌落具有辐射状沟纹，菌株2菌落则表现平坦（如图2所示）。在显微镜下进一步观察菌落，两种菌株顶囊呈球形，双层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状，分生孢子呈黑褐色球形，菌丝体发达，有隔（如图3所示）。初步判定两种菌株均为黑曲霉。

图1 菌株的透明圈观察

图2 菌株在察氏培养基下菌落形态观察

图3 菌株的孢子形态观察

2.2 目的菌株产CMCase条件的优化

2.2.1 不同碳源对菌株1和菌株2产CMCase活力的影响

为研究菌株的最佳碳源，分别利用葡萄糖、蔗糖、淀粉、滤纸和CMC-Na为唯一碳源的培养基培养菌株，对菌株的CMCase活力进行测定。由图4可见，CMC-Na为唯一碳源时，菌株1和菌株2的CMCase活性最高，显著高于其它碳源。当葡萄糖作为碳源培养菌株时，菌株CMCase分泌量比CMC-Na为唯一碳源时低，可能是以葡萄糖为碳源时引起了葡萄糖效应所致。蔗糖、淀粉和滤纸为碳源时，菌株的CMCase分泌量很少。因此，菌株1和菌株2的最佳碳源均为CMC-Na，其中菌株1的酶活力要比菌株2的酶活力高出14.2%。

图4 菌株的最佳碳源

图5 菌株的最佳氮源

2.2.2 不同氮源对菌株1和菌株2产CMCase活力的影响

为研究菌株的最佳氮源，分别利用蛋白胨、硫酸铵、酵母膏、硝酸铵和草酸为唯一氮源的培养基培养菌株，对菌株的CMCase活力进行测定。由图5可见，菌株1的最佳氮源顺序依次是酵母膏、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵和草酸铵，测得菌株1的CMCase活力之比约是17∶8∶7∶1∶1。菌株2的最佳氮源顺序依次是酵母膏、硫酸铵、草酸铵、蛋白胨和硝酸铵，测得菌株2的CMCase活力之比约是14∶12∶10∶10∶10。故菌株1和菌株2的最佳氮源均为酵母膏。酵母膏与其他氮源相比，既为菌株提供了氮源的同时，也为菌株提供了碳源和生长因子，所以菌株在以酵母膏为唯一氮源时长势最好。两种菌株利用酵母膏为氮源时，菌株2的酶活力要比菌株1的酶活力高出3.48%。

2.2.3 培养基起始pH对目的菌株产CMCase活力的影响

为研究菌株的最佳培养基起始pH，用醋酸钠―醋酸缓冲液调节培养基的pH，制成pH分别为4、5、6、7和8的培养基后，对菌株的CMCase活力进行测定。由图6可见，调节培养基的起始pH值至4时，菌株1和菌株2的CMCase活力分别是0.183 IU/mL和0.182 IU/mL。当pH值上升至7时，菌株1和菌株2的CMCase活力分别降低了27.6%和40.5%。当pH值上升至8时，菌株几乎不分泌CMCase。由此可见两种菌株的最适培养pH值均为4，该结果与Wen[26]和Latifian等[27]得出的产纤维素酶菌株培养基的最适起始pH值介于4.0～5.0一致。羧甲基纤维素钠液体培养基呈酸性，菌株从该培养基中复筛得到，因而也适应酸性环境。

图6 菌株的最佳培养pH值

图7 菌株的最佳培养温度

2.2.4 培养温度对菌株I和菌株2产CMCase活力的影响

温度设定为10、20、30、40和50℃对菌株的CMCase活力进行测定。由图7可见，温度从10℃上升至40℃时，两株菌株的CMCase活力不断提高，当温度上升至50℃时，几乎测不到两种菌株的CMCase活力。表明菌株1和菌株2的最佳培养温度均为40℃，此时菌株1的酶活力要比菌株2的酶活力高出8.97%。Sangrila等[28]的结果表明产纤维素酶菌株优化后，菌株的最适温度多集中在35～55℃。本文中菌株的最适温度是40℃，处于最适温度范围。由于菌株是从夏日中午采集的土样中进行筛选的，所以最适培养温度稍高。

2.2.5 培养时间对菌株1和菌株2产CMCase活力的影响

由图8可见，菌株产CMCase的活力均随着培养时间的增加而增大，第7 d时达到最大，此时菌株1的酶活力是菌株2酶活力的1.70倍。

图8 菌株1和菌株2的最佳培养时间

2.2.6 两种目的菌株优化后的CMCase活力

综合以上各优化条件，配制含1% CMC-Na和0.3%酵母膏，起始pH值为4的培养基，于40℃条件培养，优化后的菌株1和菌株2的CMCase活力分别是0.504 IU/mL和0.277 IU/mL。优化后菌株1和菌株2的CMCase活力分别是优化前酶活力的2.35和1.47倍，优化后菌株1的CMCase活力比菌株2高82.0%。表明菌株经过培养条件优化后，产CMCase能力有很大幅度的提高，优化后的菌株更有益于纤维素的降解。在该优化培养基中，最佳碳源CMC-Na在提供碳源的同时也提供了Na元素易于菌株的生长，同时CMC-Na作为底物，在适当浓度下可以促进菌株的CMCase分泌。最佳氮源酵母膏与其它氮源相比除了提供氨基酸外，也提供了碳源及生长因子。本文中菌株能够在以菌糠为唯一碳源的液体培养基中生势良好，原因可能在于菌糠中除了含粗纤维以外，还含有粗蛋白、粗纤维及其他Ca、Zn、Mg等微量元素[29-30]，而这些营养元素可以保证菌株正常生长，同时菌株分泌的纤维素酶可以降解菌糠中的粗纤维成分，使菌糠转化成更易于动物消化和吸收的饲料，增加菌糠的利用率。

3 结论

利用羧甲基纤维素钠培养基，采用刚果红染色法，并进一步利用液体发酵培养基筛选得到黑曲霉2株。

菌株的最适产酶条件：液体发酵培养基配方10 g/L CMC-Na，3 g/L 酵母膏，0.3 g/L MgSO4，0.3 g/L CaCl2，4 g/L KH2PO4，pH值4，培养温度是40℃，发酵培养到第7 d时，菌株1和菌株2粗酶液的CMCase活力分别达到0.504 IU/mL和0.277 IU/mL。

[1] Bayer E A, Belaich J P, Shoham Y, et al. The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell Wall polysaccharides[J]. Annual Review of Microbiology, 2004, 58: 521-524.

[2] Deutschmann R, Dekker R F H. From plant biomass to bio-based chemicals: latest developments in xylan research[J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(16): 1627-1632.

[3] 辛亚平, 昝林森, 杜双田, 等. 降解纤维素菌株筛选及其鉴定[J]. 畜牧兽医杂志, 2011, 30(5): 1-5.

[4] 赵方圆, 范宁杰, 朱建春, 等. 纤维素高效降解菌YN1的筛选及其降解特性[J]. 微生物学通报, 2010, 37(4): 496-502.

[5] 张传富, 顾文杰, 彭科峰, 等. 微生物纤维素酶的研究现状[J]. 生物信息学, 2007, 5(1): 34-36.

[6] 王亮, 尚会建, 杨立彦, 等. 纤维素酶的应用研究进展[J]. 河北工业科技, 2010, 27(6): 441-443.

[7] 陈义长, 余宪虎. XYT-1高效废纸脱墨剂的研制与应用[J]. 湖北化工, 2001, 3: 2-4.

[8] 戚建华, 姚增玉, 邓西平, 等. 板栗壳对水中Cu2+吸附性能的研究[J]. 西北农林科技大学学报/自然科学版, 2009, 37(4): 197-202.

[9] Yu Y Y, Yuan J G, Wang Q, et al. Cellulase immobilization onto the reversibly soluble methacrylate copolymer for denim washing[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 95: 675-680.

[10] Cherry J R, Fidantsef A L. Directed evolution of industrial enzymes: an update[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14: 438-439.

[11] Kirk O, Borchert T V, Fuglsang C C. Industrial enzyme applications[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13: 345- 351. [12] Qaisar S, Zohra R R, Aman A, et al. Enhanced production of cellulose degrading CMCase by newlyisolated strain of Aspergillus versicolor[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 104: 199-203.

[13] Sanjeev R, Deepa D, Matti K, et al. Bioprocessing of enhanced cellulase production from a mutant of Trichoderma asperellum RCK2011 and its application in hydrolysis of cellulose[J]. Fuel, 2014, 124: 183-189.

[14] 付传明, 何金祥, 黄宁珍, 等. 秸秆纤维素分解真菌产酶条件优化及高酶活突变株诱变选育[J]. 西南农业学报, 2010, 23(3): 714-718.

[15] Chen J, Xu L X, Wu Y. Production, characterization of acetyl esterase from a rumen bacteria strain RB3, and application potential of the strain in biodegradation of crop residues[J]. Renewable Energy, 2014, 68: 134-139.

[16] 宋安东, 王磊, 王风芹, 等. 微生物处理对秸秆结构的影响[J]. 生物加工过程, 2009, 7(4): 72-76.

[17] 刘起丽, 张建新, 葛文娇, 等. 一株产纤维素酶真菌的筛选及其对秸秆的降解效果研究[J]. 现代食品科技, 2014, 30(6): 82-86.

[18] 刘志伟, 谭兴和, 周红丽, 等. 自然制曲的蚕豆曲中优势微生物的分离与初步鉴定[J]. 中国调味品, 2011, 36(5): 97-99.

[19] 张建强, 李亚澜, 李勇. 纤维素降解菌的分离鉴定及固态发酵条件[J]. 西南交通大学学报, 2006, 41(4): 442-446.

[20] Tehater R M, Wood P J. Use of Congo Red-Polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen[J]. Applied and Environment Microbiology, 1982, 43: 777-780.

[21] 齐云, 袁月祥, 陈飞, 等. 一组纤维素分解菌的分离、筛选及其产酶条件的研究[J]. 天然产物研究与开发, 2003, 15(6): 510-512.

[22] 刘德海, 杨玉华, 安明理, 等. 纤维素酶酶活的测定方法[J]. 中国饲料, 2002, 17: 27-28.

[23] 赵亚华. 生物化学实验技术教程[M]. 广州: 华南理工大学出版社, 2000, 8: 149-151.

[24] 郑惠华, 陈惠, 张志才. 常温纤维素分解菌筛选及JSU-5产纤维素酶条件的优化[J]. 药物生物技术, 2009, 16(3): 237-240.

[25] 邵力平, 沈瑞祥, 张素轩, 等. 真菌分类学[M]. 北京: 中国林业出版社, 1984, 12: 307-309.

[26] Wen Z Y, Liao W, Chen S L. Productionof cellulase/β-glucosidase by themixed fungi culture Trichoderma reesei and Aspergillus phoenicis on dairy manure[J]. Process Biochemistry, 2005, 40: 3087-3094.

[27] Latifian M, Esfahani Z H, Barzegar M. Evaluation of culture conditions for cellulose production by two Trichoderma reesei mutants under solid state fermentation conditions[J]. Bioresource Technology, 2007, 98: 3634-3637.

[28] Sangrila S, Pallab K G, Goutam A, et al. Optimization and strain improvement by mutation for enhanced cellulase production by Bacillus sp. (MTCC10046) isolated from cow dung[J]. Journal of King Saud University-Science, 2014, 26(4): 323-332.

[29] 李加友. 菌糠综合开发利用进展[ J]. 浙江食用菌, 2009, 17(3): 45-46.

[30] 吕文亭, 刘春凌, 狄文强. 稻草菌糠对AA肉鸡生产性能及部分代谢激素水平的影响[J]. 中国家禽, 2010, 32(10): 18-20.

Isolation of Cellulase-Producting Strains and Optimization of Cellulase-Producting Conditions

ZHANG Li-ying1, WANG Han-han2, PAN Ting2, XING Cheng-hua3*, CAI Miao-zhen2
（1. College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China; 2. College of Geography and Environmental Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China; 3. Bioengineering Institute, Jinhua College of Vocation and Technology, Jinhua 321007, China）

Two cellulase-producting strains were isolated by sodium carboxymethyl cellulose medium and liquid fermentation from the rice cultivated soil. The colony morphologic, color and spore morphologic analysis suggested that the two strains were Aspergillus Niger. The premium CMCase activity and optimized cellulase-producting conditions were determined. Under the optimum condition of 1.0%CMC-Na and 0.3% yeast extract yeast extract, 4 in pH and 40℃ in temperature, the crude CMCase activities reached the maximum at 0.504 IU/mL and 0.277 IU/mL.

cellulase-produting strains; screening; CMCase; enzyme activity

Q93.331

A

1004-8405(2015)02-0001-07

2015-03-02

浙江省公益性技术应用研究计划项目（2013C32047）；金华市科技计划项目（2011-2-005）。

张丽影（1990～），女，硕士研究生；研究方向：环境修复与逆境植物生理。1138625296@qq.com

* 通讯作者：邢承华（1976～），男，博士，教授；研究方向：植物营养、植物生态。xingchenghua@ hotmail.com