维生素D受体基因多态性与黎族老年骨质疏松的易感性

维生素D受体基因多态性与黎族老年骨质疏松的易感性

吴昌新吴国志王晖1陈文生

(海南省农垦总局医院骨科，海南海口571101)

摘要〔〕目的探讨维生素D受体基因(VDR)多态性(rs11568820，Fok I酶切位点；rs1544410，Bsm I酶切位点)与黎族老年骨质疏松的易感性。方法入选118例骨质疏松患者和140例健康对照人群，采用美国双能X线测量仪检测BMD，限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术检测Fok I和Bsm I酶切位点多态性。结果全部标本中，FF、Ff、ff基因型分布频率为57.8%、37.2%、5.0%，BB、Bb、bb基因型分布频率为17.4%、45.0%、37.6%。携带Ff基因型患骨质疏松风险是携带FF基因者的1.13倍，携带ff基因型患骨质疏松风险是携带FF基因型者的1.64倍；相比于Fok I多态性位点，携带Bb基因型患骨质疏松风险是携带BB基因者的1.87倍，携带bb基因型患骨质疏松风险是携带BB基因型者的4.21倍，风险更高。结论Fok I和Bsm I酶切位点多态性与老年骨质疏松易感相关。

关键词〔〕骨质疏松；遗传易感性；限制性片段长度多态性；rs11568820；rs1544410

中图分类号〔〕R68〔文献标识码〕A〔

基金项目：海南省自然科学基金(20158347)；海南省卫生厅科学研究项目(琼卫2014-36)

1海南省干部疗养院

第一作者：吴昌新(1969-)，男，副主任医师，主要从事骨科疾病研究。

骨质疏松(OP)是受遗传和环境等因素共同作用的多因子复杂性疾病〔1〕。维生素D受体(VDR)基因多态性被认为是OP相关的重要遗传因素〔2〕。研究表明，VDR基因不同区域的多态性位点对其基因表达产生的影响不同。Bsm I位于第八号内含子上，其多态性不影响VDR氨基酸序列；Fok I酶切位点位于转录起始部位，其多态性可导致氨基酸序列长度发生改变，从而影响该基因的表达调控〔3〕。本研究探讨VDR基因多态性与黎族老年OP的遗传易感性。

1材料和方法

1.1研究对象病例组：入选2013年3月至2014年2月门诊确诊为OP患者118例，平均年龄(69±5.2)岁，其中男78例，女40例。对照组：经检查确认为非OP患者140例，平均年龄(65±6.8)岁，其中男78例，女62例。以上所有研究对象经常规检查，排除甲状腺功能亢进、糖尿病、原发性甲旁腺功能亢进、肝肾功能不全、垂体和肾上腺功能异常等影响骨代谢的疾病。

1.2骨密度(BMD)测定258例研究对象采用美国双能X线测量仪(Dual X-ray absorption-metry，DXA；GE-Lunar Prodigy)检测BMD。OP诊断标准参考1994年世界卫生组织制定以BMD测量为基础的OP症的诊断标准，以BMD值减低2.5个标准差做为OP判定标准。

1.3DNA抽提抽取研究对象2 ml EDTA抗凝血，采用QIAamp DNA Blood Kits(Qiagen)试剂盒提取全血基因组DNA，采用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测核酸质量，并保存于-20℃备用。

1.4多态性检测PCR扩增：分别设计包含Fok I和Bsm I酶切位点的PCR引物Fok I正义：5′- GGGTGGGTGGCACCAAGGAT-3′，反义：5′- CCTTTCCACTGGGGAGAGCC-3′；Bsm I正义：5′- CTGTGGTGTGTGGACGCTGA-3′，反义：5′- CCCTCTTCTCACCTCTAACCAG-3′。PCR提取如下：10倍reaction buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl24 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，上下游引物各5 μl，Taq酶5 U，去离子水补足体积至50 μl。PCR循环条件：95℃，5 min，40个循环：95℃，30s，60℃，30s，72℃，45s；72℃延伸5 min。PCR反应结束后，取5 μl进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物特异性。限制性片段长度多态性分析(RFLP)：取PCR扩增产物18 μl，加入2 μl Fok I内切酶，37℃温育3 h，反应终止后，加入5 μl 10 mmol/L EDTA终止反应，取10 μl进行2%的琼脂糖凝胶电泳分析。分型标准：等位基因均携带Fok I酶切位点(ff)，83 bp，183 bp两条带；等位基因分别携带和缺失Fok I酶切位点(Ff)，83 bp，183 bp，263 bp三条带；等位基因均缺失FOK I酶切位点(FF)，263 bp一条带。等位基因均携带Bsm I酶切位点(bb)，131 bp，192 bp两条带；等位基因分别携带和缺失Bsm I酶切位点(Bb)，131 bp，191 bp，322 bp三条带；等位基因均缺失Bsm I酶切位点(BB)，322 bp一条带。见图1。

1.5统计学分析采用SPSS18.0软件行χ2检验，并以相对风险(RR)比较不同基因型的患病风险。

M：Marker 2000，自上而下依次为2 000，1 000，750，500，250，100 bp；1：FF，263 bp一条带；2：Ff，83 bp，183 bp，263 bp三条带；3：ff，83 bp，183 bp；4：BB，322 bp一条带；5：Bb，131，191，322 bp三条带；6：bb，131 bp，192 bp两条带 图1　不同基因型电泳图

2结果

2.1Fok I酶切位点多态性与OP易感性分析全部标本中，FF、Ff、ff基因型分布频率为57.8%、37.2%、5.0%。病例组中分布频率为53.4%(63例)、39.0%(46例)、7.6%(9例)，对照组中分布频率为61.4%(86例)、35.7%(50例)、3.9%(4例)。携带Ff基因型患OP风险是携带FF基因者的1.13倍，携带ff基因型患OP风险是携带FF基因型者的1.64倍。Fok I酶切位点多态性与老年OP易感性相关。

2.2Bsm I酶切位点多态性与OP易感性分析全部标本中，BB、Bb、bb基因型分布频率为17.4%、45.0%、37.6%。病例组中分布频率为10.5%(12例)、39.8%(47例)、49.7%(59例)，对照组中分布频率为23.6%(33例)、49.3%(69例)、27.1%(38例)。携带Bb基因型患OP风险是携带BB基因者的1.87倍，携带bb基因型患OP风险是携带BB基因型者的4.21倍。Bsm I酶切位点多态性与老年OP易感性相关。

3讨论

遗传因素在OP的进展过程中发挥重要的作用，而在众多遗传因素中，VDR基因已成为热门的研究基因之一〔4〕。VDR基因位于12号染色体长臂，包含9个外显子〔5〕。Bsm I位于第八号内含子上，其多态性不影响VDR氨基酸序列；Fok I多态性位点位于该基因第二外显子的起始区，该多态性位点的存在会导致编码氨基酸的序列长度改变，影响VDR基因mRNA的表达和稳定，以及蛋白质的调节作用，从而影响骨代谢以及相关代谢指标的差异改变〔3，6〕。本研究与Mosaad等〔7〕的研究结果基本一致。本研究发现，携带Ff基因型患OP风险是携带FF基因者的1.13倍，携带ff基因型患OP风险是携带FF基因型者的1.64倍；携带Bb基因型患OP的风险是携带BB基因者的1.87倍，携带bb基因型患OP的风险是携带BB基因型者的4.21倍，风险更高。综上所述，对于导致骨质疏松症的遗传因素仍然有待深入研究。我们的结果初步揭示了VDR基因多态性与OP之间存在一定的相关性，但是对于老年OP的遗传因素、治疗和预防策略仍需进一步的深入研究。

4参考文献

1Anonymus.NIH Consensus development panel on osteoporosis prevention，diagnosis，and therapy,March 7-29,2000:hiyhlights of the conference〔J〕.South Med J，2001；94(6)：569-73.

2Uitterlinden AG，Fang Y，Bergink AP,etal.The role of vitamin D receptor gene polymorphisms in bone biology〔J〕.Mol Cell Endocrinol，2002;197(1-2)：15-21.

3Yang L，Ma J，Zhang X,etal.Protective role of the vitamin D receptor〔J〕.Cell Immunol，2012;279(2)：160-6.

4Cantorna MT，Mahon BD.Mounting evidence for vitamin D as an environmental factor affecting autoimmune disease prevalence〔J〕.Exp Biol Med，2004;229：1136-42.

5Li C，Li Y，Gao LB,etal.Vitamin D receptor gene polymorphisms and the risk of colorectal cancer in a Chinese population〔J〕.Dig Dis Sci，2009;54：634-6.

6Bai Y，Yu Y，Yu B,etal.Association of vitamin D receptor polymorphisms with the risk of prostate cancer in the Han population of Southern China〔J〕.BMC Med Genet，2009;10：125.

7Mosaad YM,Hamad EM,Fawzy W,etal.Vitamin D receptor gene polymorphism as possible risk factor in rheumatoid arthritis and rheumatoid related osteoporosis〔J〕.Hum Immunol,2014;75(5)：452-61.

〔2014-09-07修回〕

(编辑徐杰)