人牙髓干细胞的体外分离培养及表面标志鉴定

人牙髓干细胞的体外分离培养及表面标志鉴定

李伟曾常爱熊成玲汤洪胡红梅1

(井冈山大学临床医学院口腔系，江西吉安343000)

摘要〔〕目的从人正畸牙牙髓提取牙髓干细胞，并对其表面标志鉴定进行研究。方法以经典的酶联合消化细胞原代培养方法培养牙髓干细胞，镜下观察细胞，并以流式分析仪检测STRO-1 、CD34、CD45和CD146的鉴定方法对牙髓干细胞进行鉴定。结果倒置相差显微镜下观察可见细胞呈回形状或椭圆形，细胞较小，排列紧密，集落边缘细胞呈梭形，细胞大且较长，流式细胞术检测牙髓干细胞表面标志可见Stro-1，CD34、CD45和CD146为阴性。结论经典的酶联合消化细胞原代培养方法培养牙髓干细胞取得了较好的效果，可以通过检测STRO-1 、CD34、CD45和CD146的鉴定方法对牙髓干细胞进行鉴定。

关键词〔〕牙髓干细胞；体外培养；表面；标志

中图分类号〔〕R318.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：江西省科技厅资助项目(20122BBG70151-1)

通讯作者：胡红梅(1976-)，女，硕士，副教授，主要从事干细胞的分化与增殖研究。

1井冈山大学医学院组胚教研室

第一作者：李伟(1972-)，男，硕士，副教授，主要从事牙体牙髓疾病的病因及治疗研究。

临床上由于牙髓感染导致的牙髓疾病是老年人健康所面临的主要危害之一，摘除牙髓的牙齿由于缺乏营养供应，容易发生牙根纵裂和牙冠劈裂。Gronthos等〔1〕分别从牙髓中分离出克隆单位，进行了一系列体内、体外研究手段，证实了牙髓中存在具有成体干细胞特性的牙髓干细胞，这个研究结果给口腔临床医生以极大的鼓舞，如果能够在体内牙齿根管中人工再生出牙髓结构，并在牙齿根管中成活，将极大地提高患者的生活质量。因此保留感染的牙髓组织并利用牙髓干细胞再生为修复性牙本质，最大限度恢复老年人牙髓的生理状态和功能已成为口腔临床医生关注的热点。本实验拟从人拔除的正畸牙牙髓提取牙髓干细胞，并对其生物学特性进行研究，为今后的牙髓干细胞相关研究奠定基础，并为临床治疗老年患者牙髓炎提供理论依据。

1材料和方法

1.1主要试剂与仪器地塞米松(Sigma，USA)，L-抗坏血酸(Amesco，USA)，SABC试剂盒(博士德试剂公司，武汉)，免疫组化试剂盒(DAKO，USA)，抗CD34、抗CD45和抗CD146多克隆抗体(博士德试剂公司，武汉)，DMEM高糖型培养基、胎牛血清、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、dispase(GIBCO，USA)。平底24孔、96孔塑料培养板、70 pm细胞筛网(Faleon，USA)，YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)，倒置相差显微镜及照相系统(Olympus，Japan)，二氧化碳培养箱(Nuaire,America)，细胞培养瓶及培养板，高速离心机，细胞记数板，可见光分光光度计，酶联免疫检测仪。

1.2方法

1.2.1酶联合消化法细胞原代培养收集完整拔除的健康人(12～25岁)正畸牙齿，牙齿表面75%乙醇、灭菌、0.01 mol/L灭菌PBS反复冲洗后在超净工作台中轻轻取出牙髓，用眼科剪剪根尖部牙髓组织约1 mm。立即用0.01 mol/L PBS液反复冲洗，然后剪碎组织成约1～3小块，移入含0.3%的Ⅰ型胶原酶和0.4%的dipsase(1∶1)混合消化液的离心管中，37℃消化1 h，轻轻吹打离散单细胞团块，800 r/min离心5 min，0.01 mol/L PBS洗1遍。将细胞沉淀用含20%胎牛血清的高糖型DMEM培养液重悬，以1×104～1×105ml密度液，以后每3 d换液l次，并收集对数生长期的培养上清备用。每日在倒置显微镜下观察，待细胞生长达80%～90%汇合时，胰酶消化收集细胞并计数。

1.2.2牙髓干细胞鉴定取生长良好的克隆化培养细胞做细胞爬片。用ABC法按试剂盒说明进行抗CD34、CD45、CD146免疫细胞化学染色，DAB显色，光镜下观察。牙髓干细胞培养到 12 代，然后用流式细胞仪进行 STRO-1 的流式抗体表达水平的检测。步骤简述为：5×105个细胞消化成细胞悬液，PBS 清洗后用 STRO-1一抗 4℃孵育30 min，PBS 清洗2遍洗去残余抗体，后再用异硫氰酸盐荧光素(FITC)结合的 IgM 二抗孵育 4℃条件下孵育 30 min，然后用流式细胞仪进行检测。

2结果

2.1形态学观察倒置相差显微镜下观察可见细胞生长状况及基本形态：人原代牙髓干细胞第2天即可贴壁生长，部分出现集落性生长，集落生长细胞呈回形状或椭圆形，细胞较小，排列紧密，集落边缘细胞呈梭形，细胞大且较长，集落间细胞较分散，细胞形态为梭形，类似成纤维细胞样，细胞较大，第14天融合成单层细胞(图1)。

2.2流式分析仪检测流式抗体分析结果显示，经历了 12 代的传代培养，DPSC 中 STRO-1 阳性表达细胞为8.85%超过8%。流式细胞术检测牙髓干细胞表面标志CD34(1.3%)、CD45(2.4%)和CD146(12.41%)，可见CD34、CD45和CD146为阴性，符合干细胞要求，证明所培养细胞为成人牙髓干细胞。

图1　原代培养细胞的形态(×100)

3讨论

牙髓干细胞是位于牙髓组织的一种成体干细胞〔2〕。同其他组织一样，牙髓组织也具有修复与再生的能力。牙髓干细胞的成功获得表明在牙髓组织中同样存在保持未分化状态的成体干细胞，为牙齿发育研究及牙齿的再生奠定了基础。其后许多学者利用大鼠和家兔进行了系列体内、体外研究，均成功形成反应性牙髓-牙本质复合体样结构〔3〕，并进一步证实了牙髓中存在具有成体干细胞特性的牙髓干细胞〔4〕。目前牙髓干细胞的研究还处在起步阶段，大多数的研究对牙髓干细胞的培养及鉴定并没有一个权威的结论，本次实验以经典的酶联合消化法细胞原代培养方法培养牙髓干细胞取得了较好的效果，镜下观察细胞主要为胞体较大的成纤维细胞和少量小而不规则形的细胞，提示所培养的细胞可能是包含牙髓干细胞在内的混合细胞群。并以检测STRO-1 、CD34、CD45和CD146的鉴定方法对牙髓干细胞进行鉴定，可见CD34、CD45为阴性，符合干细胞要求，从 STRO-1 的流式抗体检测结果，我们也能看出来在传代第 12 代时，被人牙胚条件培养基诱导的DPSC仍然含有超过7%的STRO-1阳性细胞，人的牙胚条件培养都能较好的保持 DPSC 的干细胞特性。

牙髓干细胞的研究还处在早期摸索阶段，而且还由于缺少特异性标记，目前无法获得精确的定性、定位和纯化，因此在体外培养还存在易变性、很难进行大量的扩增等问题，所有这些限制了牙髓干细胞的发展。但是牙髓干细胞的临床应用相信有一个广阔的前景，应用在牙髓再生和临床保存活髓治疗价值方面将有一个巨大的变革。

4参考文献

1Gronthos S,Mankani M,Brahim J,etal.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs) in vitro and in vivo〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(25):13625-30.

2Kara ZE,Demircan PC,Saam O,etal,Human dental pulp stem cells demonstrate better neural and epithelial stem cell properties than bone marrow-derived mesenchymal stem cells〔J〕.Histochem Cell Biol J,2011;136(4):455-73.

3贺慧霞,金岩,史俊南，等.人牙髓干细胞的体外分离、培养及鉴定〔J〕.临床口腔医学杂志,2004;20(9):515-7.

4包柳郁,金岩,史俊南,等.人牙源性间充质细胞体内立体培养模型的建立构建组织工程化牙本质和牙髓组织〔J〕.牙体牙髓牙周病学杂志,2004;14(11):603-6.

〔2014-03-22修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)