洛伐他汀对心肌细胞转化生长因子β1和白细胞介素-6的调节

洛伐他汀对心肌细胞转化生长因子β1和白细胞介素-6的调节

郭威早杨漫杜爱华张娅喃孟令杰徐娟刘会臣

(航天中心医院临床药理室，北京100049)

摘要〔〕目的研究洛伐他汀对心肌细胞中转化生长因子(TGF)-β1和白细胞介素(IL)-6表达水平的影响。方法大鼠心肌细胞株H9c2(2-1)进行体外培养过程中，以100 nmol/L洛伐他汀处理72 h，采用蛋白免疫印迹杂交检测TGF-β1和IL-6蛋白表达水平，然后进行量化比较分析。结果洛伐他汀处理导致心肌细胞TGF-β1和IL-6蛋白表达水平分别下降到对照水平的(69.70±20.89)%和(56.26±25.04)%，两组内处理组和对照组的差异均具有统计学意义(TGF-β1组:P=0.013;IL-6组:P=0.008)。结论洛伐他汀在心肌细胞中抑制TGF-β1和IL-6的表达，该效应可能是洛伐他汀抗炎机制的关键因素之一。

关键词〔〕洛伐他汀；转化生长因子β1；白细胞介素-6；心肌；炎症

中图分类号〔〕R541.4〔文献标识码〕A〔

基金项目：航天科工集团基金(2011JKBZ006)

The regulation of lovastatin on transforming growth factor β1 and interleukin-6 in cardiac myocytes

GUO Wei-Zao,YANG Man,DU Ai-Hua,etal.

Department of Clinical Pharmacology,Aerospace Center Hospital,Beijing 100049,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the regulation of lovastatin on transforming growth factor(TGF)-β1 and interleukin(IL)-6 in cardiac myocytes.MethodsRat myocardium H9c2(2-1) cells in culture were treated with 100 nmol/L lovastatin for 72 h. The protein levels of TGF-β1 and IL-6 were detected through immunoblotting and then quantitatively comparing. ResultsAfter treatment with lovastatin,the average protein levels of myocardial cellular TGF-β1 and IL-6 were decreased to(69.70±20.89)% and(56.26±25.04)% respectively with statistical significances for both TGF-β1(P=0.013) and IL-6(P=0.008). ConclusionsLovastatin inhibits protein levels of both TGF-β1 and IL-6 in cardiac myocytes,which might constitute a key factor in the anti-inflammation mechanisms of lovastatin.

【Key words】Lovastatin;Transforming growth factor β1;Interleukin-6;Myocardium;Inflammation

第一作者：郭威早(1967-),女,硕士，副主任医师，主要从事临床药理及心血管内科疾病研究。

炎症反应在心血管疾病如冠心病发病中的重要作用〔1〕。在某种意义上，一些心血管疾病如动脉粥样硬化的本质就是复杂性炎性疾病〔2〕。近年来，炎症分子生物学的一个重要进展就是对转化生长因子(TGF)-β在炎症调节中作用的认识，例如对T淋巴细胞功能的影响和多种白细胞相互作用等〔3〕。但该细胞因子在心血管疾病中的作用，特别是炎症调控作用基本上处于未明状态。炎症反应的另一个重要分子白细胞介素(IL)-6与心血管的关系很早就受到关注，其中一个重要原因就是与C-反应蛋白(CRP)之间的关系〔4〕。洛伐他汀是代表性降脂药，我们既往的研究对其抗炎作用进行了探索〔5〕，本研究检测了洛伐他汀对TGF-β1及IL-6的调节作用，基于此探索了心血管病治疗中抗炎的分子机制。

1材料与方法

1.1心肌细胞培养和药物处理大鼠心肌细胞H9c2(2-1)由ATCC公司购得。细胞培养采用本课题组针对该细胞株建立的培养方法：采用DMEM培养基加10%胎牛血清，在5% CO2,37℃条件下培养。一轮培养3 d，然后按1∶4的比例分盘继续培养，细胞脱壁收集采用0.25%(重量/体积)胰蛋白酶合并0.53 mmol/L EDTA溶液处理10 min。洛伐他汀(Sigma-Aldrich公司)用二甲基亚砜稀释至100 μmol/L作为原液，在细胞贴壁达到培养皿底面积约75%时，加入洛伐他汀至细胞培养液，使终浓度达到100 nmol/L，继续培养72 h。

1.2蛋白免疫印迹杂交心肌细胞通过1 000 r/min，10 min离心收集后，重悬于1.0 ml冰冷裂解缓冲液，再转移至2.0 ml Eppendorf管中。裂解缓冲液包括：20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5),1 mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA,2.5 mmol/L焦磷酸钠,1% Triton X-100,150 mmol/L氯化钠,1 mmol/L β-磷酸甘油。临使用前加入5 mmol/L二硫苏糖醇，1%磷酸酶抑制剂Cocktail Ⅰ,1%磷酸酶抑制剂Cocktail Ⅱ,10%磷酸酶抑制剂Cocktail(磷酸酶抑制剂购自Sigma-Aldrich公司)。样本通过Virtis超声细胞粉碎仪进行超声剪切(设置2.0,处理1 s×10次)，然后，样本在14 000 r/min离心5 min去除不溶性沉渣。蛋白浓度测定采用Pierce公司BCA蛋白试剂盒进行。等量的蛋白加入到SDS-PAGE进行电泳分离然后电转移至硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜上的非特异结合通过以下杂交液屏蔽。杂交液包括Tris缓冲盐水，0.1%吐温-20，5%脱脂牛奶。TGF-β和IL-6抗体(Santa Cruz生物技术公司)根据产品说明书稀释并根据初始测试调整，正式实验中采用1∶200的比例稀释。次级抗体为辣根过氧化物酶耦联的抗兔抗体。β-肌动蛋白抗体(Cell Signaling 公司)用作上样对照。免疫复合物用ECL加强型试剂盒(Amersham/GE公司)探测。免疫印迹的定量分析采用Syngene G:BOX凝胶建档及分析系统(Syngene公司)进行。

1.3统计学分析计量资料行双侧配对t检验。

2结果

2.1洛伐他汀处理降低心肌细胞TGF-β1水平体外培养的大鼠H9c2(2-1)心肌细胞经洛伐他汀72 h处理后，与对照相比无显著形态学改变。洛伐他汀处理后，TGF-β1蛋白水平(110.23±33.03)%降低至对照组水平(158.14±38.65)%的(69.70±20.89)%，变化率-30.30%，改变具有显著的统计学意义(P=0.013)。

2.2洛伐他汀处理降低心肌细胞IL-6水平与TGF-β1水平的改变类似，体外培养的大鼠H9c2(2-1)心肌细胞经洛伐他汀72 h处理后，IL-6蛋白水平(69.59±30.98)%降低至对照组水平(123.70±47.67)%的(56.26±25.04)%，变化率-43.70%，差异具有统计学意义(P=0.008)。

图1　洛伐他汀处理后心肌细胞 TGF-β1和IL-6蛋白水平的变化

3讨论

洛伐他汀作为羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，是降脂药的代表，其降脂作用被长期的临床实践所证实。近来的研究注意到此类调脂药物的其他药理效应，其中在心血管方面最值得关注的就是其抗炎作用。本研究在课题组既往研究的基础上〔5,6〕进行了进一步的扩展。研究发现，在心肌细胞中，洛伐他汀对TGF-β1和IL-6均具有抑制效应。

TGF-β是近期受到高度关注的免疫调节分子靶点。该细胞因子至少具有3个亚型，即TGF-β1～3，其中以TGF-β1研究得最为广泛和深入，故本研究选取TGF-β1为研究对象。TGF-β1调节细胞生长、分化和凋亡等，与众多疾病，特别是伴随各种免疫失调的疾病相关，其中包括心血管病。TGF-β1在疾病中的作用非常复杂，甚至相互矛盾，诱发或抑制均有可能〔7,8〕，因此吸引了大量的研究者关注。

IL-6 一个重要的结构特征是螺旋细胞因子结构，其他一些具有同样结构的细胞因子因此归入IL-6家族，其中包括心脏营养因子(cardiotropin)-1，由此也可见IL-6及其家族分子在心血管疾病中举足轻重的作用。与TGF-β1在疾病中表现的复杂性一样，IL-6在疾病中的作用也十分复杂，具有多面性〔9〕。

洛伐他汀在心肌细胞水平上抑制TGF-β1和IL-6，有可能作为其抗炎机制的基础之一，但鉴于本研究涉及的2个细胞因子具有复杂性作用机制，对本研究结果的结论性解读尚需进一步的实验研究和临床观察。

4参考文献

1Libby P,Tabas I,Fredman G,etal.Inflammation and its resolution as determinants of acute coronary syndromes〔J〕.Circ Res,2014;114(12):1867-79.

2Duchatelle V,Kritikou EA,Tardif JC.Clinical value of drugs targeting inflammation for the management of coronary artery disease〔J〕.Can J Cardiol,2012;28(6):678-86.

3Yoshimura A,Wakabayashi Y,Mori T.Cellular and molecular basis for the regulation of inflammation by TGF-beta〔J〕.J Biochem,2010;147(6):781-92.

4Bastard JP,Jardel C,Delattre J,etal.Evidence for a link between adipose tissue interleukin-6 content and serum C-reactive protein concentrations in obese subjects〔J〕.Circulation,1999;99(16):2221-2.

5Guo W,Liu H,Li L,etal.Regulation of lovastatin on a key inflammation-related microRNA in myocardial cells〔J〕.Chin Med J(Engl),2014;127(16):2977-81.

6Guo WZ,Ji H,Yan ZH,etal.Lovastatin changes activities of lactate dehydrogenase A and B genes in rat myocardial cells〔J〕.Chin Med J(Engl),2011;124(3):423-8.

7Clancy RM,Buyon JP.Clearance of apoptotic cells:TGF-beta in the balance between inflammation and fibrosis〔J〕.J Leukoc Biol,2003;74(6):959-60.

8Wahl SM.Transforming growth factor beta(TGF-beta)in inflammation:a cause and a cure〔J〕.J Clin Immunol,1992;12(2):61-74.

9Mathew S,Bartels J,Banerjee I,etal.Global sensitivity analysis of a mathematical model of acute inflammation identifies nonlinear dependence of cumulative tissue damage on host interleukin-6 responses〔J〕.J Theor Biol,2014;358:132-48.

〔2014-12-21修回〕

(编辑徐杰)