老年非小细胞肺癌患者胸腔积液ERCC1表达与胸腔灌注顺铂联合化疗的临床疗效及预后的关系

老年非小细胞肺癌患者胸腔积液ERCC1表达与胸腔灌注顺铂联合化疗的临床疗效及预后的关系

柳志宝张菁华宋京花吴媛媛赵瑾史英高敬华

(沧州市中心医院肿瘤内科，河北沧州061001)

摘要〔〕目的观察胸腔灌注顺铂联合化疗对老年非小细胞肺癌(NSCLC)患者胸腔积液核苷酸切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达的影响，评价以铂类为基础的化疗药物的临床疗效。方法入选100例老年NSCLC伴恶性胸腔积液患者，引流胸腔积液，采用荧光定量PCR检测ERCC1 mRNA的相对表达水平。予以胸腔内灌注顺铂，每次40～60 mg，共2～3次，1 w内完成，灌注期间同时给予全身化疗，1个月后影像学检测评价化疗药物的灌注疗效。结果相对于管家基因β-actin，ERCC1 mRNA的相对表达水平为0.63，其水平与病理类型无相关性(P=0.118)。治疗1个月后，ERCC1 mRNA高表达组治疗总有效率低于低表达组(72.73% vs.91.18%，P=0.039)。1年后ERCC1 mRNA低表达组中位生存率明显高于高表达组(10.8 vs.7.5个月，P=0.022)。结论老年NSCLC胸腔积液中ERCC1表达可作为一种评价以铂类为基础化疗药物临床疗效的生物学指标。

关键词〔〕非小细胞肺癌;ERCC1;顺铂

中图分类号〔〕R736〔文献标识码〕A〔

基金项目：沧州市科技计划项目〔131302047〕

通讯作者：史英(1981-)，女，硕士，主治医师，主要从事恶性肿瘤的综合治疗研究。

第一作者：柳志宝(1981-)，男，主治医师，硕士，主要从事恶性肿瘤的诊疗研究。

恶性胸腔积液为非小细胞肺癌(NSCLC)晚期最常见的并发症之一，严重影响患者生活质量。以顺铂为基础联合第三代化疗药物(紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨)组成的化疗方案是目前治疗NSCLC的标准化疗方案，但联合化疗的有效率只有30%～40%，5年生存率无明显改善〔1,2〕。对于病理类型相同、分期相同的晚期老年NSCLC患者给予相同方案、相同剂量的化疗，个体疗效差异明显，与肿瘤药物耐药性相关。关于顺铂耐药的研究成为近年来的研究热点〔3〕。核苷酸切除修复交叉互补基因(ERCC)1是核苷酸切除修复途径中的关键因子之一，其表达水平与铂类化疗药物的疗效相关〔4〕。以往研究多取材于肿瘤组织或外周血检测ERCC1的表达，而对于肺癌伴恶性胸腔积液患者，较难获得满意的肿瘤组织进行ERCC1的检测，另外由于胸腔积液多数是由于肿瘤侵犯胸膜所致，而胸膜腔属于相对密闭器官，肿瘤组织或外周血ERCC1的表达尚不能完全替代胸腔积液中ERCC1的表达，因此留取胸腔积液进行ERCC1的检测可能对化疗药物疗效的预测更为敏感。本实验前瞻性观察胸腔内灌注顺铂联合化疗方案对老年NSCLC患者胸腔积液中ERCC1表达的影响。

1材料与方法

1.1研究对象2011年10月至2012年12月我科收治老年NSCLC患者100例，平均年龄(71.56±18.54)岁，男68例，女32例。所有患者均经支气管镜下活检或穿刺活检获得病理学诊断，鳞癌32例，腺癌63例，其他5例。所有患者均完善血常规、肝肾功能、凝血功能、心电图、胸片等检查。

1.2试剂与仪器PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，Quant cDNA第一链合成试剂盒、RealMasterMix(SYBR Green)试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，3K30超速冷冻离心机(美国Sigma公司)，Rotor-Gene Q型实时荧光定量PCR仪(上海Qiagen公司)。

1.3治疗方法所有患者经CT或超声定位后无菌条件下行胸腔穿刺置管闭式引流术，置入单腔中心静脉导管，间断负压引流，尽量在24 h内排净胸腔积液。予以胸腔内灌注顺铂，每次注入40～60 mg，共2～3次，1周内完成，每次灌注完毕后嘱患者变换体位30 min，灌注治疗期间同时给予全身化疗，以第三代化疗药物吉西他滨、紫杉醇、长春瑞滨为主。1个月后影像学评价化疗药物的灌注疗效，疗效判定标准参照WHO标准，即：完全缓解(CR)：经治疗后胸腔积液完全吸收，症状消失，至少维持30 d以上；部分缓解(RR)：经治疗后胸腔积液显著减少在50%以上，症状改善，并维持30 d以上不需要抽液者；无效(NC)：经治疗后胸腔积液减少不足50%或治疗后30 d内必须再抽液者；进展(PD)：治疗后胸腔积液显著增加或患者死亡。有效率(RR)=CR+PR。

1.4ERCC1测定①收集胸腔积液1 000 ml，加入20 000 U肝素抗凝，将胸水13 000 r/min离心1 min，弃去上清液，收集管底细胞。②将收集到的细胞重悬，加入900 μl Cell Lysis Solution，室温孵育10 min，13 000 r/min室温离心20 s，弃去部分红色上清液，重悬白色沉淀。③加入300 μl Nuclei Lysis Solution，混匀，再加入100 μl Protein Precipitation Solution，剧烈振荡20 s，13 000 r/min室温离心3 min。④取上清液至新的已灭菌1.5 ml EP管中，加入300 μl异丙醇，盖上管盖，上下颠倒混匀，可见白色絮状DNA析出，13 000 r/min室温离心1 min，弃上清。加入300 μl 70%乙醇，轻柔上下颠倒洗涤沉淀，13 000 r/min室温离心1 min，弃上清，吸干残留液体。⑤样本PCR产物电泳：ERCC1 C19007T/C8092A产物片段大小在200 bp内，配制100 ml、2%琼脂糖凝胶，计算琼脂糖的用量和制胶 TAE缓冲液的用量后，制备琼脂糖凝胶，按100 V，30 min进行电泳，在成像系统中得到图像。⑥加入100 μl DNA Rehydration Solution至沉淀，进行PCR扩增，扩增条件：95℃预变性15 min，然后进行35个循环，包括95℃变性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸30 s。⑦焦磷酸测序，进行结果判读。

1.5随访1年后对所有100例患者进行随访，记录主要不良事件发生情况，包括胸腔积液复发、肿瘤新发转移、死亡等。

1.6统计学方法采用SPSS16.0软件进行统计分析，计量资料以中位数表示，计数资料比较采用χ2检验，Spearman相关性分析基因表达量与病理类型之间的关系，单因素生存分析应用Kaplan-Meier曲线。

2结果

2.1胸腔积液ERCC1表达水平检测的100例老年NSCLC患者中，ERCC1相对管家基因β-actin RNA的相对表达水平为0.63(0.005～1.143)，以ERCC1 mRNA中位相对表达水平0.63为界，分为ERCC1 mRNA高表达组(≥0.63)66例和ERCC1 mRNA低表达组(<0.63)34例。ERCC1 mRNA高表达组鳞癌17例(25.76%)，腺癌47例(71.21%)，其他类型2例(3.03%)，ERCC1 mRNA低表达组鳞癌9例(26.47%)，腺癌24例(70.59%)，其他类型9例(2.9%)，ERCC1 mRNA表达水平与病理类型未见明显差异(P=0.118)。

2.2两组疗效比较胸腔灌注顺铂联合化疗治疗1个月后，ERCC1 mRNA高表达组治疗总有效率为72.73%CR23例(34.85%)，PR25例(37.88%)，NC13例(19.7%)，PD1例(2.94%)，低表达组治疗总有效率为91.18%，CR14例(41.18%)，PR17例(50.00%)，NC2例(5.89%)，PD1例(2.94%)，低表达组总有效率高于高表达组(P=0.039)。

2.3ERCC1 mRNA表达水平与老年NSCLC患者生存的关系100例老年NSCLC患者中位生存率为8.7个月，经胸腔灌注顺铂联合化疗后ERCC1 mRNA低表达组的中位生存率明显高于ERCC1 mRNA高表达组(10.8 vs.7.5个月，P=0.022，见图1)。

图1　老年NSCLC患者生存期曲线

3讨论

NSCLC占肺癌总数的80%左右，病情发生、发展较为隐匿，当临床症状、体征较为明显而被患者察觉后多数已经发展到Ⅲ期或Ⅳ期〔5，6〕，常引起恶性胸腔积液，手术切除率低、预后差，严重影响老年患者的生活质量及生存期。

以顺铂为基础联合第三代化疗药物(紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨)组成的化疗方案是目前治疗NSCLC的标准化疗方案，但有效率仍然很低。研究表明，即便给予顺铂化疗方案、给药剂量相同，临床疗效也可产生很大差异〔7，8〕，这种差异主要取决于顺铂的耐药性问题。顺铂抗癌作用的主要靶点为DNA双链中鸟嘌呤的N7位点，作用时通过DNA-Pt-DNA结构形成DNA链间内部交联、链间交联或通过DNA-Pt-蛋白形成DNA-蛋白交联，破坏DNA正常结构，阻碍DNA的模板作用，从而抑制DNA复制和转录过程〔9〕。既往实验发现，患者体内DNA损伤修复能力增强时可导致其对顺铂产生耐药性，DNA损伤修复主要通过核苷酸切除修复途径进行，而ERCC1在核苷酸剪切修复中发挥关键性作用〔10,11〕。

本研究发现，老年NSCLC患者胸腔积液中ERCC1 mRNA的相对表达水平为0.63，证明ERCC1 mRNA相对表达水平升高可能参与顺铂抗药性过程，但ERCC1 mRNA表达水平与病理类型未见明显相关，表明ERCC1基因的启动表达不依赖于NSCLC病理类型。ERCC1 mRNA低表达组治疗总有效率高于ERCC1 mRNA高表达组(P=0.039)，这表明胸腔灌注顺铂联合化疗方案对老年NSCLC患者具有较好的临床治疗效果，安全有效，临床上值得推广应用。且ERCC1 mRNA低表达组中位生存率明显高于高表达组，故胸腔积液中ERCC1可能作为一种生物学标记物用以评价患者预后。

4参考文献

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3鞠放，汪青，清水汪，等.晚期非小细胞肺癌p53和ERCC1表达状态与顺铂为主的联合方案化疗的近期有效率的相关性研究〔J〕.现代生物医学进展，2012;5(12)：876-9.

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7丛莹莹，刘美艳，蔡莉，等.胸腔灌注奈达铂与顺铂治疗非小细胞肺癌恶性胸腔积液的疗效比较〔J〕. 中华肿瘤杂志，2010;32(6)：467-9.

8任剑，吕赛平，徐炎良.非小细胞肺癌组织表达ERCC1与顺铂耐药的相关性分析〔J〕. 江西医药，2014;49(3)：194-6.

9董云，李志革.ERCC1、BRCA1在非小细胞肺癌的表达与顺铂耐药的研究进展〔J〕.现代肿瘤学，2010;5(18)：1037-40.

10陈佳，谭清和.ERCC1在非小细胞肺癌个体化治疗中的研究进展〔J〕.国际病理科学与临床杂志，2012;32(2)：150-3.

11华之卉，房之铮，赵忠全，等.ERCC1和ERCC4基因多态性对NSCLC患者顺铂疗效的影响〔J〕. 中国临床药理学与治疗学，2011;16(7)：772-8.

〔2014-03-18修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)