联合水蛭注射液后处理对脑缺血损伤大鼠磷酸化内皮型一氧化氮合酶表达的影响

联合水蛭注射液后处理对脑缺血损伤大鼠磷酸化内皮型一氧化氮合酶表达的影响

胡跃强唐农1吴林1孙淑荣梁妮易灿辉1

(广西中医药大学第一附属医院神经内科，广西南宁530023)

摘要〔〕目的观察缺血后处理(IPOC)联合水蛭注射液后处理对脑缺血损伤大鼠磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS) mRNA及其蛋白表达的影响。方法SD大鼠40只，随机分为假手术组(SO组)、缺血再灌注对照组(MCAO组)、IPOC组、IPOC+水蛭注射液后处理组(P-L组)四组。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型及IPOC模型，应用实时荧光定量PCR和Western印迹技术检测p-eNOS mRNA及其蛋白表达变化。结果SO组有少量p-eNOS mRNA及其蛋白表达；MCAO组大鼠脑缺血再灌注24 h缺血半暗带p-eNOS表达较SO组明显增高(P<0.05)；IPOC组二者的表达水平较MCAO组明显升高(P<0.05,P<0.01)；P-L组能较IPOC组进一步升高其表达(P<0.05,P<0.01)。结论脑IPOC可能通过诱导p-eNOS的表达发挥其神经保护作用，水蛭注射液后处理可进一步促进其表达而发挥神经保护作用。

关键词〔〕缺血后处理；水蛭注射液；磷酸化内皮型一氧化氮合酶

中图分类号〔〕R285〔文献标识码〕A〔

基金项目：广西自然科学基金(2012GXNSFAA053075);广西卫生厅重点课题(重2012046)

通讯作者：唐农(1962-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事缺血性脑血管病研究。

1广西中医药大学

第一作者：胡跃强(1973-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事缺血性脑血管病研究。

缺血后处理(IPOC)是近年发现的重要内源性脑保护机制，因其能减轻脑缺血/再灌注(I/R)损伤而引起广泛关注〔1〕，并已成功地应用于临床〔2〕。最近研究发现，蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(Akt/eNOS)信号途径参与了I/R损伤，发挥神经保护效应〔3〕。相对于IPOC手段，药物后处理简便易行，因此更具有应用前景。水蛭注射液经临床研究证实对脑卒中先兆和脑梗死急性期有确切治疗作用的中药制剂〔4,5〕，但其后处理效应及疗效机制有待于进一步阐明。本实验通过比较IPOC和联合水蛭注射液后处理对I/R损伤后Akt/eNOS转导信号通路的关键蛋白eNOS磷酸化(p-eNOS)水平的影响，以探讨二者的神经保护机制。

1材料和方法

1.1 动物分组及处理健康雄性SD大鼠40只，体质量(250±50)g，随机将大鼠分为4组：假手术组(SO组)、缺血再灌注对照组(MCAO组)、IPOC组、IPOC+水蛭注射液后处理组(P-L组)。分别作如下处理：SO组：仅实施假手术但不进行脑缺血操作，同时腹腔注射生理盐水4 ml；MCAO组：实施90 min的脑缺血和24 h的再灌注，在再灌注即刻腹腔注射生理盐水4 ml；IPOC组：在再灌注即刻自CCA内抽出线栓30 s，然后将线栓重新置入30 s，反复进行此操作3次后进行再灌注24 h，并在再灌注即刻腹腔注射生理盐水4 ml；P-L组：在IPOC组操作的基础上，在再灌注即刻，腹腔注射水蛭注射液4 mg/kg。

1.2 造模方式参照Longa的线栓法建立大鼠MCAO动物模型。分离并结扎大鼠左颈外动脉远端和颈总动脉近端，将前端用火焰烧圆的尼龙线从颈总动脉残端插入，进线约18~20 mm，大脑中动脉缺血(MCAO)后90 min抽出线栓，完成脑缺血。然后参照文献〔6〕行缺血后处理，即在再灌注即刻自CCA内抽出尼龙线栓30 s，然后将线栓重新置入30 s，反复进行此操作3次后进行再灌注24 h。

1.3 药物制备水蛭选用菲牛蛭，又称广西菲牛蛭。采用稀醇渗漉提取，再经跨热处理法制得水蛭注射液，每支2 ml，每毫升含生药1 g，由本院制剂室制备。

1.4 主要试剂兔抗大鼠p-eNOS (Ser1177)多克隆抗体(Santa Cruz)，耦联有辣根过氧化物(HRP)羊抗兔IgG二抗(博士德公司)，内参GAPDH(康成生物公司)，总RNA提取试剂盒(TIANGEN公司)，PCR反应试剂盒及逆转录试剂盒(TaKaRa公司)，引物及内参均由大连宝生物有限公司提供。

1.5 缺血半暗带脑皮质p-eNOS mRNA表达测定①大脑组织总RNA提取：参考Trizol试剂盒说明书提取总mRNA；②引物合成：荧光定量RT-PCR所用p-eNOS和GAPDH引物序列如下：p-eNOS正义：5′- GGGCCAGGGTGATGAGCTCTG-3′；反义：5′-CCCTCCTGGCTTCCAGTGTCC -3′；产物长度为324 bp；GAPDH正义5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3′；反义5′-GTGGAAGAATGGGAGTT GCTGT-3′，产物长度610 bp；③比较两基因扩增效率：选取cDNA样品模板进行5倍梯度稀释，p-eNOS与GAPDH分别进行real-time PCR反应，得出荧光曲线，通过cDNA浓度梯度的log值对ΔCT值作图比较两基因扩增效率；④反应体系及条件：两种基因同管扩增，反应体系均为10 μl，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×) 5 μl ，cDNA模板1.0 μl、两种基因上下游引物(10 pmol/μl)各0.4 μl、探针(10 pmol/μl)各0.4 μl，加无RNA酶的水至3.2 μl。在DNA Engine OpticonTM2 连续荧光检测系统(MJ Research公司)中进行扩增反应，反应条件为：94℃预变性30 s，95℃ 5 s，58.2℃ 20 s，62.0℃ 20 s，35个循环，4℃保存。每例样品及阴性对照均设4个平行复孔，取均值。

1.6 缺血半暗带脑皮质内p-eNOS蛋白表达测定缺血侧顶叶大脑皮质约100 mg，冰上研磨组织后加预冷的蛋白裂解液，继续碾磨至液态，然后4℃，14 000 r/min 离心15 min，提取上清液，取20 μl用 BCA法进行蛋白定量测定，所剩上清液配一致蛋白浓度，并按4∶1的比例加上样，各样本提取等量总蛋白(60 μg)，经100℃ 5 min变性后，采用10%SDS-PAGE进行垂直电泳进行分离，电泳后将凝胶上的蛋白条带电转移至PVDF膜上进行免疫反应。5%脱脂奶粉室温封闭2 h ，然后依次加入兔抗p-eNOS抗体，37℃孵育2 h，4℃过夜；耦联有辣根过氧化物(HRP)羊抗兔IgG 室温孵育2 h。Beyo ECL Plus超敏发光液中X-感光盒内曝光。以上反应均在塑料袋内进行，其间用TBST充分洗涤。将胶片进行扫描或拍照，采用Alpha Ease FC软件进行图像分析，获取各组Western印迹条带的平均光密度(OD)值，内参为GAPDH，目的蛋白与内参光密度比值即为目的蛋白的相对值。

1.7 统计学方法采用SPSS11.0行单因素方差分析及LDS-t检验。

2结果

2.1 p-eNOS mRNA表达变化SO组有少量p-eNOS mRNA表达；MCAO组大鼠脑缺血再灌注24 h缺血半暗带p-eNOS mRNA表达较SO组明显增高(P<0.05)；IPOC组其表达水平较MCAO组明显升高(P<0.01)；P-L组能较IPOC组进一步升高其表达(P<0.05)。见表1。

2.2 p-eNOS蛋白表达的变化SO组有少量蛋白表达(0.814±0.057)；MCAO组缺血半暗带p-eNOS蛋白表达较SO组明显增高(1.066±0.065,P<0.05)；IPOC组其表达水平较MCAO组明显升高(1.248±0.083，P<0.05)；P-L组能较IPOC组进一步升高其表达(1.512±0.133，P<0.01，图1)。

表1　各组p-eNOS mRNA相对量的表达变化

与SO组比较：1)P<0.05；与MCAO组比较：2)P<0.01；与IPOC组比较：3)P<0.05

图1　各组大鼠p-eNOS蛋白的表达

3讨论

IPOC是指长时间缺血后，于再灌注前短时间内进行反复短暂的再灌和停灌，可明显减轻缺血组织和器官的再灌注损伤。最近研究显示Akt/eNOS通路在I/R损伤的保护机制中发挥着重要的作用〔3,7〕，该通路是细胞内重要的脑保护防御机制之一，上调此信号通路可对抗多种凋亡基因的表达，发挥细胞保护作用。但该通路是否参与了IPOC的保护机制鲜见报道。eNOS是Akt的重要下游底物之一，也是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，活化的Akt与eNOS结合后，诱导eNOS向细胞膜转位，磷酸化其N端的Ser活性位点而使eNOS失活，从而阻滞其对下游蛋白的磷酸化阻止凋亡发生，发挥神经保护作用。

药物后处理是指在长时间缺血后,于再灌注前或再灌注开始的几分钟内用药,通过药物干预来减轻器官的再灌注损伤。其保护作用机制与IPOC相似,但药物后处理更具有临床应用价值,为器官再灌注损伤的治疗提供了新策略。目前已证实，药理学刺激亦能通过外源性机制诱发后处理现象，即能够进一步增强IPOC的器官保护作用〔8,9〕。但是，目前的药物后处理主要是局限在吸入麻醉药物，如异氟烷和七氟烷等，即所谓的“麻醉药物后处理”〔10〕。而中药以其疗效明显、副作用小、多靶点的作用途径而成为IPOC研究的热点。水蛭是广西的优势中药品种，我院自上世纪90年代开始对水蛭进行临床药理学研究，在国内率先对其剂型进行改良制成水蛭注射液，经临床及动物实验证实它对脑缺血损伤具有良好的治疗作用〔4,5,11,12〕。但联合水蛭注射液后处理尚未涉及神经保护领域，是一个崭新的研究方向。本结果提示联合2种后处理方式有协同作用效果。

4参考文献

1Zhou C,Tu J,Zhang Q,etal. Delayed ischemic postconditioning protects hippocampal CA1 neurons by preserving mitochondrial integrity via Akt/GSK3β signaling〔J〕.Neurochem Int,2011;59(6):749-58.

2Hausenloy D,Yellon D.Preconditioning and postconditioning:underlying mechanisms and clinical application〔J〕.Atherosclerosis,2009;204(2):334-41.

3Yoshitomi H,Iwaoka E,Kubo M,etal. Beneficial effect of Sparassis crispa on stroke through activation of Akt/eNOS pathway in brain of SHRSP〔J〕.J Nat Med,2011;65(1):135-41.

4董少龙,乔丽.水蛭注射液治疗中风先兆证188例〔J〕.实用中医内科杂志,1998;12(2):29-30.

5梁健芬,李桂贤,黄选华.水蛭注射液对急性脑梗死患者血液流变学、SOD的影响及临床疗效观察〔J〕.广西中医药,2000;23(1):1-3.

6Zhao H,Sapolsky RM,Steinberg GK. Interrupting reperfusion as a stroke therapy:ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2006;26(9):1114-21.

7Park SH,Kim JH,Park SJ,etal.Protective effect of hexane extracts of Uncaria sinensis against photothrombotic ischemic injury in mice〔J〕.J Ethnopharmacol,2011;138(3):774-9.

8Ebner B,Lange SA,Eckert T,etal.Uncoupled eNOS annihilates neuregulin-1β-induced cardioprotection:a novel mechanism in pharmacological postconditioning in myocardial infarction〔J〕.Mol Cell Biochem,2013;373(1-3):115-23.

9O′Sullivan JC,Yao XL,Alam H,etal. Diazoxide,as a postconditioning and delayed preconditioning trigger,increases HSP25 and HSP70 in the central nervous system following combined cerebral stroke and hemorrhagic shock〔J〕.J Neurotrauma,2007;24(3):532-46.

10Liu HG,Hua Z,Zhang Y,etal. Effect of Sevoflurane postconditioning on gene expression in brain tissue of the middle cerebral artery occlusion rat model〔J〕.Mol Biol Rep,2012;39(12):10505-13.

11董少龙,刁丽梅,窦维华.水蛭注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的防治作用及其机制〔J〕.广西中医药,2004;27(1):47-50.

12梁健芬,董少龙,胡跃强,等.水蛭注射液对大鼠脑缺血再灌注TNF-α、IL-1β和ICAM-1蛋白表达的影响〔J〕.陕西中医杂志,2006;35(12):1605-7.

〔2013-12-08修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)