睫状神经营养因子对糖尿病大鼠海马胆碱乙酰转移酶表达及认知功能的影响

睫状神经营养因子对糖尿病大鼠海马胆碱乙酰转移酶表达及认知功能的影响

黄薇杨巧刘霞张莉夏丽肖谦

(重庆医科大学附属第一医院老年科，重庆400016)

摘要〔〕目的探讨睫状神经营养因子(CNTF)对糖尿病(DM)大鼠海马胆碱乙酰转移酶(ChAT)表达及认知功能的影响及机制。方法50只SD大鼠随机分为正常对照组、DM组、DM+DMSO组、DM+CNTF组和DM+CNTF+AG490组，每组10只。腹腔注射建立链脲佐菌素(STZ)DM大鼠模型，Open-field实验排除抑郁DM大鼠，Morris水迷宫测试大鼠逃避潜伏期和穿越目标区域次数，Western印迹以及免疫组化检测大鼠海马ChAT蛋白水平，RT-PCR检测ChAT mRNA水平。结果与正常对照组相比，DM组、DM+DMSO组及DM+CNTF+AG490组逃避潜伏期延长(P<0.05),穿越目标区域次数减少(P<0.05)，海马部位ChAT mRNA和蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)；与DM组相比，DM组+CNTF组大鼠逃避潜伏期时间及穿越目标区域次数的成绩明显改善(P<0.05),海马部位ChAT mRNA和蛋白的表达水平明显升高(P<0.05)。结论CNTF对DM大鼠认知功能有改善作用，其机制可能与通过JAK2/STAT3途径上调ChAT mRNA和蛋白表达水平有关。

关键词〔〕睫状神经营养因子；糖尿病脑病；胆碱乙酰转移酶；认知功能

中图分类号〔〕R587.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(81170752)；重庆市自然科学基金CSTC(2010BB5396)；重庆市卫生局科研项目(重点)(2010-1-8)

通讯作者：肖谦(1956-)，男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事老年内分泌代谢研究。

第一作者：黄薇(1984-)，女，在读硕士，医师，主要从事老年内分泌代谢研究。

Effects of ciliary neurotrophic factor on the expression of choline acetyltransferase in hippocampus and the cognitive function of diabetic rats

HUANG Wei，YANG Qiao, LIU Xia,etal.

Department of Geriatrics,the First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of ciliary neurotrophic factor(CNTF) on the expression of choline acetyltransferase (ChAT) in hippocampus and cognitive function of diabetic mellitus(DM), and explore its possible mechanism.Methods50 SD male rats were meanly divided into normal, DM, DM+DMSO, DM+CNTF, DM+CNTF+AG490 groups randomly. Streptozotocin-diabetic rats model were established, diabetic rats with depression were screened by open-field test. Escape latency and frequency of entrance into the target zone were measured by Morris water maze. The mRNA and protein levels of ChAT were examined with RT-PCR，Western blot and immunohistochemistry.ResultsCompared to that of normal group，escape latency was increased and frequency of entrance into the target zone was decreased significantly in DM,DM+DMSO and DM+CNTF+AG490 groups(P<0.05),the mRNA and protein levels of ChAT in hippocampal were decreased significantly(P<0.05) .The scores of escape latency and frequency of entrance into the target zone were highly improved in DM+CNTF group，the mRNA and protein expressions of ChAT in hippocampal were increased markedly than those of DM group(P<0.05) .ConclusionsCNTF could improve cognitive ability of DM rats by increasing the mRNA and protein expressions of ChAT through the JAK2/STAT3 pathway.

【Key words】Ciliary neurotrophic factor; Diabetic encephalopathy; Choline acetyltransferase；Cognition

睫状神经营养因子(CNTF)与神经系统发育、功能维持和损伤修复有密切的关系，是一种能够促进多种神经细胞存活，在神经系统发育、分化和损伤修复中具有重要作用的神经营养因子。CNTF对阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、糖尿病视网膜病变及周围神经病变等均有改善作用，但对糖尿病认知功能障碍发病过程有无影响至今未见报道。本研究拟观察 CNTF对糖尿病(DM)大鼠海马胆碱乙酰转移酶(ChAT)表达水平及认知功能的影响，探讨DM认知功能障碍可能的发病机制。

1材料与方法

1．1材料链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)；血糖仪(德国拜耳公司)；大鼠脑立体定位仪(美国Stoelting公司)；Morris水迷宫及水迷宫记录分析系统 (中国淮北正华生物仪器设备有限公司研制)；CNTF(美国PeproTech公司)；兔抗大鼠ChAT多克隆抗体(abcam公司)；AG490(美国Sigma公司)；RNA总抽提试剂，逆转录试剂盒，DNA marker DL500(TaKaRa公司)；引物合成:上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2方法

1．2．1动物分组与处理SPF级Spraque-Dawley(SD)雄性大鼠50只,8～10周龄,体重180～220 g,购自重庆医科大学动物实验中心。动物适应喂养1 w后,随机分为正常对照组(C组)、DM组、DM+二甲基亚砜(DMSO)组、DM+CNTF组和DM+CNTF+AG490组，每组10只，注射STZ建立DM模型。成模后第11周,各组均进行矿场(Open-field)实验,排除抑郁DM大鼠。随后进行Morris水迷宫测试,测试结束后给予各组大鼠侧脑室注射，持续注射1 w后,所有实验大鼠再次进行水迷宫测试。实验终点DM+CNTF+AG490组大鼠死亡1只。

1．2．2Open-field实验以穿越底面的格数及后肢站立次数记录水平运动次数和垂直运动次数，了解大鼠的活动度及其对新鲜环境的好奇程度,并计数修饰次数。

1．2．3Morris水迷宫测试DM模型建模成功后第11周,训练3 d,第4天进行隐藏平台获得实验,分析潜伏期,测试学习能力。第5天撤去平台进行空间搜索实验，去除平台观察2 min内大鼠通过原平台的次数,测试记忆能力。CNTF及AG490干预1 w后重复上述实验。

1．2．4CNTF干预成模后第11周,各组大鼠水迷宫测试完毕即予CNTF及AG490干预。大鼠经4%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉后,固定于脑立体定位仪上,沿颅顶正中线剪开头皮暴露颅骨,大鼠侧脑室穿刺坐标〔1,2〕:前囟后1.0 mm,右1.5 mm,深3.5 mm。微型电钻沿此穿刺点钻孔。将带内芯的不锈钢套管(外径0.86 mm,内径 0.5 mm)垂直插入侧脑室内,牙托粉黏合固定套管,凝固后缝合伤口。术后大鼠予以青霉素抗炎并分笼饲养。导管置入后第4天进行侧脑室注射。①正常对照组和DM组注射等量生理盐水；②DM+DMSO组注射等量2.99%DMSO(<3%)；③DM+CNTF组：微量注射器3 min内将CNTF(0.5 nmol/L,2 μl)〔3〕缓慢匀速注入侧脑室，留针约1 min；④DM+CNTF+AG490组：微量注射器3 min内将CNTF(0.5 nmol/L,2 μl)和AG490(29 nmol/L,2 μl)〔4〕缓慢匀速注入侧脑室，留针约1 min；各组大鼠每天给药1次，连续7 d。

1．2．5RT-PCR法大鼠断头,低温下快速取出海马组织,液氮冻存。按RNA提取试剂说明书提取海马的总RNA。ChAT上游引物序列5'CCAGTTCTTTGTCTTGGATGTT3′，下游引物序列5'GGACGCCATTTTGACTATCTTT3′，扩增长度为94 bp；β-actin上游引物序列5'CACCCGCGAGTACAACCTTC3′，下游引物序列5'CCCATACCCACCATCACACC3′，扩增长度为207 bp。反应体系：cDNA 2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，pre-Taq PCR 12 μl，ddH2O 9 μl。 ChAT反应条件:94℃预变性2 min;94℃ 30 s，56.3℃退火40 s，72℃延伸30 s,40个循环;72℃再延伸10 min;4℃保存。β-actin反应条件：94℃预变性 2 min;94℃ 30 s，57.8℃退火40 s，72℃延伸30 s,35个循环;72℃再延伸10 min;4℃保存。取上述PCR产物5 μl用2% 琼脂糖进行凝胶电泳。凝胶成像分析系统扫描 RT-PCR电泳结果,Quantity One软件测定Volumn值,计算ChAT /β-actin比值。

1．2．6Western 印迹称取-80℃冰箱保存的海马组织100 mg，加入0.2 ml RIPA和2 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)，超声细胞破碎仪低温匀浆，离心后二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，蛋白质转膜，免疫印迹，电化学发光法(ECL)显影后条带经凝胶成像软件分析，以ChAT/β-actin条带灰度比值表示ChAT蛋白的相对表达水平。

1．2．7免疫组化采用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法。处死大鼠,1%多聚甲醛心脏灌注取脑,石蜡包埋连续冠状切片,根据试剂盒说明检测 ChAT在各组大鼠海马的表达。

2结果

2．1Morris水迷宫测试结果DM组、DM+DMSO组及DM+CNTF+AG490组逃避潜伏期增加,与正常对照组比较差异显著(P<0.05)。DM+CNTF组较DM组逃避潜伏期明显缩短，通过原平台位置次数明显增加(P<0.05),与正常对照组比较无明显差异(P>0.05)。见表1。

2．2ChAT mRNA及蛋白的表达与正常对照组比较，DM 组、DM+DMSO组及DM+CNTF+AG490组 ChAT mRNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.05)；与 DM 组、DM+DMSO组及DM+CNTF+AG490组比较，DM +CNTF组ChAT mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见图1，图2，表2。

2．3免疫组化结果与正常对照组相比，DM组、DM+DMSO组及DM+CNTF+AG490组海马 ChAT阳性神经元明显降低；DM+CNTF组与DM组、DM+DMSO组及DM+CNTF+AG490组比较,上述指标明显增加,但仍少于正常对照组。见图3，表2。

表1　大鼠空间搜索实验及隐蔽平台搜索实验结果 ± s)

与正常对照组比较：1)P<0.05,；与DM组比较：2)P<0.05;与DM+CNTF组比较：3)P<0.05；下表同

M:Markers;A:正常对照组；B:DM组；C:DM+DMSO组；D:DM+CNTF组；E:DM+CNTF+AG490组；下图同 图1　各组大鼠海马区ChAT mRNA的表达

图2　Western印迹检测各组大鼠海马ChAT蛋白表达

组别nChAT/β-actin(mRNA)ChAT/β-actin(蛋白)ChAT平均光密度正常对照组100.74±0.050.29±0.030.24±0.01DM组100.27±0.021)3)0.17±0.021)3)0.17±0.021)DM+DMSO组100.27±0.021)3)0.17±0.011)3)0.18±0.021)DM+CNTF组100.51±0.031)0.26±0.011)0.23±0.011)DM+CNTF+AG490组90.26±0.021)3)0.17±0.021)3)0.17±0.021)3)

图3　各组大鼠海马区ChAT免疫组化染色结果(×400)

3讨论

CNTF因最初从鸡的睫状神经节中提取出来而得名，属神经营养因子家族成员，是目前公认的影响大脑认知功能的一种内源性调节因子，主要分布在成人大脑的海马颗粒下层。细胞培养显示，CNTF对基底前脑胆碱能等多种神经元有营养作用，并通过激活Janus蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活子3(JAK2/STAT3)途径发挥作用。乙酰胆碱是影响认知功能的一种重要神经递质，ChAT作为胆碱能神经递质合成过程中最关键的酶，直接决定生物体内乙酰胆碱的含量，是调节认知功能的重要蛋白质。前期研究证实，糖尿病认知功能障碍早期基底前脑、海马等处胆碱能神经元存在明显退行性改变，ChAT表达减少〔5〕，提示ChAT的差异性表达参与了DM认知功能障碍的发生、发展过程。

本研究通过建立DM大鼠模型，发现成模后DM大鼠学习记忆能力下降,认知功能已经受损，ChAT可能参与此过程；侧脑室注射外源性CNTF后，DM大鼠学习和记忆能力明显改善，可能与上调海马区ChAT表达水平有关；本实验还发现，当CNTF作用被JAK2拮抗剂AG490阻断后,大鼠水迷宫测试潜伏期延长,穿越目标区域次数减少,但海马区ChAT mRNA和蛋白表达量仍较对照组显著降低，提示CNTF上调海马区ChAT mRNA和蛋白表达，改善DM大鼠认知功能障碍的效应部分是通过JAK2/STAT3信号途径实现的。除此以外，CNTF改善DM大鼠认知功能的作用还可能存在其他机制。CNTF能缓解脑缺血造成的空间认知障碍，组织学研究显示皮质的梗死灶和同侧丘脑神经元逆行性变形均有改善；CNTF对感觉神经元、运动神经元、海马胆碱能神经元及黑质多巴胺能神经元等均有促进存活及防止损伤的作用。

综上所述，我们有理由推测CNTF至少部分通过JAK2/STAT3途径〔6~9〕，改善神经元退行性变化，上调海马区ChAT表达水平，促进胆碱能神经递质的合成，这可能是其改善DM认知功能障碍的又一重要途径。

4参考文献

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〔2013-12-17修回〕

(编辑袁左鸣/徐杰)