二甲双胍对大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响

二甲双胍对大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响

杨迪顾俊菲叶山东

(安徽医科大学附属省立医院内分泌科，安徽合肥230001)

摘要〔〕目的探讨不同浓度二甲双胍对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响及其对糖尿病肾病(DN)的保护机制。方法将大鼠肾小球系膜细胞分别培养在正常对照组(NC组)、高糖(HG组)及高糖+不同浓度二甲双胍组。48 h后，比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量，RT-PCR方法测定细胞p22phox和p47phox mRNA表达情况。结果与NC组比较，HG组MCs p22phox和p47phox mRNA表达明显增加，上清液SOD活力明显降低，MDA含量明显增高(P<0.05)。二甲双胍干预高糖组MCs p22phox和p47phox mRNA表达明显低于HG组(P<0.05)，且二甲双胍浓度越高，MCs p22phox和p47phox mRNA表达越低。结论二甲双胍可降低高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞3-磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)氧化酶表达水平，从而起到减轻氧化应激的作用，该作用在二甲双胍治疗糖尿病时表现为对肾脏的保护作用。

关键词〔〕二甲双胍；系膜细胞；氧化应激

中图分类号〔〕R587〔文献标识码〕A〔

基金项目：安徽省自然科学基金(No.11040606M161)；安徽高校省级自然科学研究项目(No.KJ2011A157)

通讯作者：叶山东(1964-)，男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事糖尿病及其并发症研究。

第一作者：杨迪(1990-)，女，在读硕士，主要从事糖尿病及其并发症研究。

糖尿病肾病(DN)为糖尿病患者最常见的微血管并发症。DN发病机制复杂，尚不完全明确。近年来，研究证实高血糖引起的氧化应激是DN的重要发病机制之一。二甲双胍作为治疗糖尿病的一线药物，已在临床广泛使用，一些研究证实其对糖尿病患者肾脏存在降糖外的保护作用〔1〕，部分可能与其减轻氧化应激有关，但其减轻氧化应激的效果并未得到证实，同时其机制也尚不清楚。本实验通过应用不同浓度二甲双胍干预高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)，观察不同浓度二甲双胍下大鼠细胞氧化应激水平的区别，探讨二甲双胍对肾脏作用的可能机制。

1材料与方法

1.1材料大鼠GMCs由中国典型培养物保藏中心提供；DMEM培培养液由上海杰美基因医药科技有限公司生产，双抗购自美国Hyclone公司，胎牛血清(FBS)由美国Life Technologies生产，胰酶消化液购自碧云天生物公司；二甲双胍购自美国Sigma公司，脂质氧化(MDA)试剂盒及超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒由美国罗氏公司生产，RNA抽提试剂(Trizol)购自美国Invitrogen公司，逆转录及PCR试剂盒由美国Life Technologies生产，PCR引物由北京优博兰基因技术有限公司提供。

1.2方法

1.2.1细胞培养GMCs进行常规培养，培养液为含10%FBS与1%双抗的低糖DMEM液，DMEM液中葡萄糖(Glu)浓度为5.6 mmol/L。将GMCs细胞置于以上培养液中并于培养箱中培养，环境条件设定为37℃，5% CO2浓度，并采用胰酶消化。以上细胞传代2～3次/w，并选择4～6代细胞进入分组环节。

1.2.2分组与处理将进入分组的细胞采用胰酶处理后接种于6孔细胞培养板上，接种密度控制2×105/孔，继续培养24 h。待细胞贴壁后，吸去原有培养液，并采用1%FBS低糖DMEM培养液，培养液中葡萄糖浓度为5.6 mmol/L，共培养24 h确保选择细胞生长同步化后，进行分组处理。将以上细胞共分为五组，①正常对照组(NC组)：DMEM液(Glu 5.6 mmol/L)；②高糖组(HG组)：DMEM液(Glu 25 mmol/L)；③二甲双胍1组(Met 1组)：HG+met(0.5 mmol/L)；④二甲双胍2组(Met 2组)：HG+met(1.0 mmol/L)；⑤二甲双胍3组(Met 3组)：HG+met(2.0 mmol/L)，对于Met1、Met2及Met3三组细胞采用设定的二甲双胍浓度干预24 h。以上五组细胞共培养48 h，吸取各组细胞上清液及细胞进入检测环节，对于检测指标共设置6个重复组。

1.2.3SOD与MDA含量测定严格按照对应试剂盒操作说明书进行，并实施质量控制。

1.2.4RT-PCR检测大鼠GMCs p22phox mRNA和p47phox mRNA表达扩增p22phox基因引物序列：上游5′-GACGCTTCACGCAGTGGTACT-3′，下游5′-CACGACCTCATCTGTCACTGG-3′，扩增产物的大小为485 bp。扩增p47phox基因引物序列：上游5′-CAGAATGTTGCCTGGTTG-3′，下游5′-GTGCCCTCCCTTAGATGA-3′，扩增产物的大小为416 bp。扩增3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因引物序列为：上游5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′，下游5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′，扩增产物的大小为308 bp。p22phox的PCR反应条件：95℃下预变性3 min后进入循环，循环条件为94℃下变性1 min，63.3℃下退火1 min，并在72℃下延伸1 min，循环次数共计30次，循环后在72℃下延伸10 min后4℃下保存。p47phox的PCR反应条件与p22phox区别在于退火温度设定为58.5℃；GAPDH的PCR反应条件为94℃下预变性3 min后进入循环，循环条件为94℃下变性30 s，52℃下退火1 min，并在72℃下延伸1 min，循环次数总计35次。循环结束后于72℃下延伸10 min后于4℃下保存。将以上PCR所得产物取10 μl于2%琼脂糖凝胶中电泳分析，并采用溴化乙锭染色后拍照，进行吸光度扫描。根据条带光密度计算p22phox/GAPDH与p47phox/GAPDH条带光密度比值，并根据计算值计算各因子基因产物的相对表达量。

1.3统计学方法采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1各组GMCs上清液中SOD活性和MDA水平的影响MDA含量HG组〔(11.39±0.41)nmol/ml〕显著高于NC组〔(5.59±0.42)nmol/ml〕；各二甲双胍组均较HG组含量降低，但均高于NC组(P<0.05);Met1组含量〔(8.79±0.44)nmol/ml〕高于Met2组〔(7.48±0.56)nmol/ml〕以及Met3组〔(7.20±0.37)nmol/ml〕(P<0.05)，但Met2组与Met3组MDA含量无明显差异。与NC组〔(12.22±0.75)U/ml〕比较，HG组SOD活性〔(7.66±0.55)U/ml〕明显下降(P<0.05)，各二甲双胍组经不同浓度二甲双胍干预，SOD活性较HG组不同程度升高(P<0.05)；其中，Met1组〔(9.00±0.69)U/ml〕与Met2组〔(9.08±1.35)U/ml〕SOD活性无明显差异，但Met1与Met3组〔(10.63±0.34)U/ml〕、Met2组与Met3组SOD活性均存在差异(P<0.05)。

2.2各组GMCs p22phox、p47phox mRNA表达水平经高糖刺激后，HG组p22phox、p47phox mRNA表达水平(1.22±0.02，0.81±0.02)明显高于NC组(0.63±0.02，0.58±0.27)(P<0.01)；Met1组(1.09±0.01，0.71±0.18)、Met2组(0.90±0.01，0.65±0.02)及Met3组(0.67±0.02，0.60±0.02)p22phox、p47phox mRNA表达水平均低于HG组(P<0.05)，但仍高于NC组。Met1与Met2组，Met1与Met3组，Met2与Met3组之间p22phox和p47phox mRNA表达均有差异(P<0.05)。见图1。

图1　各组GMCs p22phox、p47phox mRNA相对表达量

3讨论

DN是由糖尿病引起的微血管病变，可导致终末期肾病，是糖尿病患者主要致死原因之一。其病理变化早期主要为肾小球肥大，肾小球基底膜与系膜区增厚增宽。后期疾病进展，肾小球基底膜增厚呈弥漫性并伴随基质增生，形成结节，最终导致肾小球硬化。DN发病机制尚未完全明确，目前普遍认为与高血糖引起的代谢紊乱、遗传环境因素、血流动力学改变等有一定关系，其中高血糖血症介导的氧化应激起着关键作用〔2，3〕。

机体中存在氧化与抗氧化双重作用。氧化应激产物包括活性氧自由基(ROS)及活性氮自由基(RNS)两类，而抗氧化系统主要包括酶抗氧化系统及非酶抗氧化系统两类。在酶抗氧化系统中，SOD可催化超氧化物歧化生成氧气和过氧化氢，在细胞抗氧化机制中发挥重要作用〔4〕。MDA作为自由基作用于脂质过氧化产生的终末产物，可间接反映机体氧化损伤水平。p47phox和p22phox为GADPH氧化酶亚单位，是调控ROS生成的酶的主要来源〔5〕。糖尿病患者中普遍存在氧化应激产物增多及抗氧化能力降低，其直接表现是大量氧化中间产物的增多及清除减少，最终导致组织氧化损伤〔6〕。

二甲双胍是被广泛推荐为治疗糖尿病的一线首选药物，近年来一些临床研究显示二甲双胍可减轻患者体内氧化应激反应〔7〕。Alhaider等〔8〕研究报告二甲双胍可通过上调CAT等氧化因子的mRNA水平的表达来减少氧化应激，保护DN大鼠的肾脏，且这种保护作用独立于降糖之外。本试验提示高糖培养的GMCs存在氧化应激。经过不同浓度二甲双胍干预后，高糖刺激培养下增强的GMCs p22phox和p47phox mRNA表达明显降低，细胞培养上清液SOD活性明显升高，MDA含量明显降低且呈一定的浓度依赖性。但二甲双胍减轻GMCs氧化应激的机制尚不十分明确，可能与其通过激活AMPK-FOXO3信号通路诱导抗硫氧还原蛋白表达〔9〕，在脂肪组织中促解偶联蛋白2表达有关〔10〕。Forbes等〔11〕报道二甲双胍还可通过降低肾脏组织的非酶糖基化作用，从而降低肾小球氧化应激损伤。本研究显示二甲双胍可降低高糖介导的大鼠GMCs p22phox和p47phox表达，从而起到调控活性氧自由基生成的效果，减轻高糖血症引起的氧化应激损伤，并表现出二甲双胍使用剂量与两种基因mRNA表达水平负相关性，因此推测可能该效应为二甲双胍对DN肾脏保护作用的机制。

4参考文献

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6Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications：a unifying mechanism〔J〕.Diabetes，2005；54(6)：1615-25.

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8Alhaider AA，Korashy HM，Sayed-Ahmed MM，etal.Metformin attenuates streptozotocin-induced diabetic nephropathy in rats through modulation of oxidative stress genes expression〔J〕.Chem Biol Interact，2011；192(3)：233-42.

9Hou X，Song J，Li XN，etal.Metformin reduces intracellular reactive oxygen species levels by upregulating expression of the antioxidant thioredoxin via the AMPK-FOXO3 pathway〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2010；396(2)：199-205.

10Anedda A，Rial E，González-Barroso MM，etal.Metformin induces oxidative stress in white adipocytes and raises uncoupling protein 2 levels〔J〕.J Endocrinol，2008；199(1)：33-40.

11Forbes JM，Cooper ME，Thallas V，etal.Reduction of the accumulation of advanced glycation end products by ACE inhibition in experimental diabetic nephropadiy〔J〕.Diabetes，2002;51(11)：3274-82.

〔2015-04-19修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)