P16及CyclinD1在胃癌癌变过程中的作用及意义

P16及CyclinD1在胃癌癌变过程中的作用及意义

刘亮张建海左连富

(河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞室，河北石家庄050011)

摘要〔〕目的通过检测慢性萎缩性胃炎、胃不典型增生组织及胃癌组织中P16及CyclinD1蛋白的表达，探讨P16及CyclinD1与胃癌发生及发展的关系。 方法利用免疫组织化学方法检测慢性萎缩性胃炎、胃不典型增生组织及胃癌中P16及CyclinD1蛋白的表达水平，利用SPSS软件进行胃癌组织中P16及CyclinD1蛋白表达相关性分析。结果P16蛋白在慢性萎缩性胃炎组织中的阳性表达率(91.7%)显著高于不典型增生组织(69.2%)及胃癌组织(45%)中的表达(P<0.05)。CyclinD1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率(65%)显著高于胃不典型增生组织(34.6%)及慢性萎缩性胃炎组织(29.2%)中的表达(P<0.05)。统计学结果显示，胃癌组织中P16及CyclinD1蛋白的阳性表达率呈显著负相关(P<0.05)。 结论P16及CyclinD1蛋白异常表达在胃癌癌变早期即已发生，联合检测P16及CyclinD1可为胃癌早期诊断提供客观指标。

关键词〔〕胃癌；基因；细胞周期素；免疫组织化学

中图分类号〔〕R735.2〔文献标识码〕A〔

基金项目：河北省医学科学研究重点课题(20110131);河北省自然科学基金(H2013206446)

通讯作者：左连富(1949-)，男，教授，主要从事肿瘤病理学研究。

第一作者：刘亮(1981-)，男，副教授，博士，主要从事肿瘤的早期诊断及治疗研究。

Role of P16 and CyclinD1 protein expression in the process of gastric cancer and its significance

LIU Liang,ZHANG Jian-hai,ZUO Lian-Fu.

Department of FCM Analysis,Tumor Institute,the Forth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,Hebei,China

Abstract【】ObjectiveTo explore the relationship between the P16 and CyclinD1 protein expression level and the development of gastric cancer by detecting the P16 and CyclinD1 protein expression in chronic atrophic gastritis,gastric dysplasia and gastric cancer tissue.MethodsExpressions of P16 and CyclinD1 protein in chronic atrophic gastritis,gastric dysplasia and gastric cancer tissue were detected by immunohistochemistry and the relationship between the P16 and CyclinD1 protein expression in gastric cancer was analyzed by SPSS software.ResultsThe positive expression rate of P16 protein in chronic atrophic gastritis(91.7%)was significantly higher than that of gastric dysplasia(69.2%)and gastric cancer tissue(45%)(P<0.05).The positive expression rate of CyclinD1 protein in gastric cancer tissue(65%)was significantly higher than that of gastric dysplasia(34.6%)and chronic atrophic gastritis(29.2%)(P<0.05).P16 and CyclinD1 protein positive expression rate in gastric cancer tissue was significantly negative correlation(P< 0.05).ConclusionsThere are abnormal expressions of P16 and CyclinD1 protein in early gastric cancer,the combined detection of P16 and CyclinD1 protein could provide objective index for early diagnosis of gastric cancer.

【Key words】Gastric neoplasms;Gene;Cyclin;Immunohistochemistry

胃癌是较常见的恶性肿瘤〔1〕，近年发病率上升〔2〕，然而，胃癌的病因及发病机制目前仍未阐明，为临床上胃癌的早期诊断及治疗带来一定困难。目前对于肿瘤发生机制研究认为，多种癌基因及抑癌基因的异常从而导致了肿瘤的发生。p16基因是抑癌基因，对正常细胞周期起负调控作用，同时是抑制肿瘤细胞生长的关键因子〔3,4〕。CyclinD1基因是一种原癌基因，是细胞周期的正性调控因子，可促进细胞增殖〔5〕。本课题探讨P16及CyclinD1蛋白在不同病变的胃组织中的表达水平。

1材料与方法

1.1组织标本采用河北省肿瘤研究所病理研究室存档胃镜咬检的石蜡包埋胃黏膜组织50例(慢性萎缩性胃炎24例，不典型增生26例)及河北医科大学第四医院病理科2003年2月至2003年8月手术切除胃癌标本20例，均有完整的病理资料。其中不典型增生组织轻度14例，中重度12例；胃癌组织中，中高分化9例，低分化11例。所有标本常规石蜡包埋制成4 μm厚切片4张，其中一张切片HE染色进行病理形态学观察，其余3张切片用于免疫组织化学染色。

1.2主要仪器及试剂鼠抗人p16单克隆抗体(ZM-0205;克隆系：16P07)，鼠抗人细胞周期素D1单克隆抗体(ZM-0084;克隆系：DCS-6)，Sp试剂盒(sp-9000)及DAB显色剂，美国Santa Cruz公司。

1.3免疫组织化学染色方法福尔马林固定、石蜡包埋的病理组织块切成4 μm厚切片，每个蜡块各做4张切片。第一张用于HE染色，第二张用0.01%PBS代替一抗作为阴性对照，第三、四张分别行抗P16、CyclinD1抗体标记P16、CyclinD1蛋白，免疫组织化学染色用链菌素亲生物素-过氧化物酶(SP)法。常规脱蜡至水，3%甲醇H2O2溶液室温10 min，而后用蒸馏水冲洗，磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min。柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)95℃以上孵化20 min。每张切片加5 μl 10% 山羊血清封闭10 min。分别滴加50 μl P16、CyclinD1(均为即用型)单克隆抗体，4℃冰箱过夜。其后PBS冲洗3次，每次5 min。滴加50 μl链霉素蛋白-过氧化氢酶溶液，用以标记二抗，孵育30 min，其后PBS冲洗3次，每次5 min。分别滴加50 μl辣根酶标记链霉素卵白素工作液，室温下孵育30 min，其后PBS冲洗3次，每次5 min。每张切片滴加100 μl左右新鲜配置的DAB溶液显色，镜下观察显色反应，显色适度时终止反应，一般15～30 min。流水冲洗后，蒸馏水洗一次，苏木素复染细胞核4 min后，分化，返蓝，常规脱水、透明、封片。

1.4免疫组织化学方法检测P16及CyclinD1蛋白表达判断标准P16参照Geradts〔6〕标准，细胞核或细胞质着棕黄色为阳性细胞。阴性(-)表示未见阳性着色细胞，或仅有胞质着色而每高倍镜下胞核着色细胞个数≤1；弱阳性(+)表示着色较浅或着色细胞数≤25%者；阳性()表示着色深度适中或着色细胞数占25%～50%者；强阳性()表示着色较深或着色细胞数>50%者；所有阳性样本必须满足每高倍镜下核着色细胞个数≥2。CyclinD1参考Betticher等〔7〕标准：未见阳性细胞或阳性细胞表达弱，阳性细胞表达<20%为阴性(-)，中等强度的表达≥20%为阳性(+)，≥50%为强阳性()。

1.5统计学方法应用SPSS10.0统计学分析软件对数据的组间比较进行分析，计数资料组间比较行χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析方法。

2结果

2.1不同胃病变组织中P16蛋白表达水平慢性萎缩性胃炎区域，可见腺上皮萎缩、变性，部分腺体呈囊性扩张，P16蛋白表达于细胞核和细胞质内，呈强阳性表达；B区为不典型增生区域，表现为腺体形状大小不规则、分枝或囊性扩张，排列紊乱，上皮细胞数量增加，核变卵圆形或笔杆状，排列拥挤，位于细胞的基底部，P16蛋白呈阳性表达；胃腺癌组织中腺管结构不明显，癌细胞分化较差，大小不甚一致，核常呈复层，P16蛋白呈弱阳性表达(图1)。各组样本中均有不同程度的P16蛋白表达，P16蛋白在慢性萎缩性胃炎组中阳性表达率(91.7%)显著高于不典型增生组(69.2%，P<0.05)，不典型增生组与胃癌组(45.8%)之间无显著性差异(P>0.05)，轻度不典型增生组(78.6%)与中～重度不典型增生组之间无显著性差异(58.3%，P>0.05)，中～高分化腺癌与低分化腺癌之间无显著性差异(55.6% vs 36.4%，P>0.05)。

图1　不同病变组织P16、CyclinD1蛋白表达(DAB，×100)

2.2不同胃病变组织中CyclinD1蛋白表达水平慢性萎缩性胃炎组织，CyclinD1蛋白表达于细胞核内，呈弱阳性表达； 不典型增生组织，CyclinD1蛋白呈阳性表达；胃腺癌组织，CyclinD1蛋白呈强阳性表达(图1)。各组样本中均有不同程度的CyclinD1蛋白表达，CyclinD1蛋白在胃癌组中阳性表达率显著高于不典型增生组(65.0% vs 34.6%,P<0.05)，不典型增生组与慢性萎缩性胃炎组(30.4%)间无显著差异(P>0.05)，中～重度不典型增生组与轻度不典型增生组之间无显著性差异(50% vs 27.3%,P>0.05)，低分化腺癌与中～高分化腺癌之间无显著性差异(81.8% vs 44.4%,P>0.05)，CyclinD1蛋白在慢性萎缩性胃炎组中表达率最低(29.2%)，随着病变进展，其阳性表达率逐渐升高。

2.3胃癌组织中P16和CyclinD1蛋白表达水平相关性分析胃癌组织中P16和CyclinD1蛋白表达呈显著负相关(r=-0.555，P=0.011)。

3讨论

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，发病率居世界第二位，具有较强的局部侵袭和远处转移能力，致死率较高。胃癌的病因及发病机制目前仍未阐明，但研究发现癌症的发生是多因素、多因子参与的，多种癌基因激活及抑癌基因的失活从而导致癌的发生及发展。

p16基因是由Kamb等〔8,9〕发现的抑癌基因，定位于p21不到40 kb的范围内，由三个外显子和两个内含子组成。三个外显子长度分别为126，307和11 bp，编码一个16 kD的蛋白，即P16蛋白。P16既是正常细胞周期有效调控者(负反馈调节作用)，又是抑制肿瘤生长的关键成分。P16蛋白能与CyclinD1竞争性地结合CDK4和CDK6，抑制其活性，使其一系列底物(如pRb)保持持续去磷酸化高活性，而不能解除pRb对转录因子E2F等的抑制，从而阻止细胞G1期进入S期，直接抑制细胞增殖。因此，p16基因异常，可导致细胞异常增殖和肿瘤发生。

本研究显示，各组样本中均有不同程度的P16蛋白表达，P16蛋白在慢性萎缩性胃炎组中阳性表达率显著高于不典型增生及胃癌组，P16蛋白在胃癌中表达率最低，随着病变从慢性萎缩性胃炎→不典型增生→癌的进展，其阳性表达率逐渐降低，提示P16蛋白低表达与胃癌发生、发展有关。文献报道〔10〕p16基因缺失是胃癌发生的早期事件。不典型增生与慢性萎缩性胃炎比较P16蛋白表达显示明显的差异至胃癌出现显著缺失，其原因可能是P16基因以多种机制参与肿瘤的发生。

CyclinD1基因是一种原癌基因，由351个腺嘌呤、392个胞嘧啶、376个鸟嘌呤和206个胸腺嘧啶组成。Inaba等〔11〕报道了cyclinD1基因在11q13的位置上。Hinds等〔12〕证实了CyclinD1有致癌作用。CyclinD1是细胞周期的正性调控因子，与CDK4/CDK6结合并使之激活，活化的CDK4/CDK6使视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)在G1-S转换期发生磷酸化，释放出E2F，进一步激活S期相关基因的转录，推动细胞从G1期进入S期。本研究显示，CyclinD1蛋白在胃癌组中阳性表达率显著高于不典型增生及慢性萎缩性胃炎组，随着病变从慢性萎缩性胃炎→不典型增生→癌的进展，其阳性表达率逐渐升高，与文献报道一致〔13,14〕，提示CyclinD1蛋白高表达可能发生在胃粘膜上皮癌变的早期阶段，是重要的胃癌促发因素，可将其认为是胃癌发生的早期事件。综上，P16和CyclinD1蛋白异常表达在早期胃癌即已发生，且P16和CyclinD1蛋白表达呈现负相关性，联合检测P16和CyclinD1蛋白可为早期胃癌诊断提供客观指标，提高临床上早期胃癌的诊断率，对于临床上胃癌的早期诊断及治疗具有重要意义。

4参考文献

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〔2014-06-25修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

《中国老年学杂志》被国际数家数据库、检索性期刊检索机构收录情况

根据国际检索机构给中国科学技术期刊编辑学会国际交流工作委员会、中国高等学校自然科学学报研究会对外联络委员会发来的电子邮件及其附件统计整理, 《中国老年学杂志》2009年又被4种国际重要检索系统列为来源期刊:

1)美国化学文摘(CA)，CODEN ZLZHAO，http://www.lib.dlut.edu.cn/layersec.asp；

2)波兰《哥白尼索引》(IC, Index of Copernicus), http://journals.indexcopernicus. com/karta. Php;

3)日本《科学技术社(中国文献数据库)》(JST, Japan Science & Technology Agency) (Chinese Bibliographic Database);

4)美国《乌利希期刊指南》(UPD,Ulrich′s Periodicals Directory), http://www. ulrichsweb. com/ ulrichsweb/