转化生长因子-β1对巨噬细胞泡沫化过程的影响及其机制

转化生长因子-β1对巨噬细胞泡沫化过程的影响及其机制

张凤香贺成业李晨光罗俊生

(辽宁医学院附属第一医院心外科，辽宁锦州121001)

摘要〔〕目的研究转化生长因子(TGF)-β1是否能通过胆固醇酯水解酶(CEH)对巨噬细胞的泡沫化过程产生影响。方法ox-LDL(100 mg/L)作用48 h，使巨噬细胞转化为泡沫细胞；Ad-TGF-β1和(或)siRNA CEH作用于巨噬细胞,作用48 h后,分别采用油红O染色检测阳性细胞数量；HPLC观察巨噬细胞内胆固醇代谢情况；Western印迹检测巨噬细胞内CD36和SR-A1蛋白的表达情况。结果油红O染色阳性细胞数量：空白对照组59.54±4.01、Ad-TGF-β1组15.12±1.23、Ad-TGF-β1+ siRNA CEH组89.01±3.67、siRNA CEH组94.28±5.22。巨噬细胞内胆固醇酯(CE)、游离胆固醇(FC)和总胆固醇(TC)含量；与空白对照组比较，Ad-TGF-β1+siRNA CEH组和siRNA CEH组均增加(P<0.05)；而Ad-TGF-β1组均明显下降 (P<0.05)。Western印迹法检测发现：与空白对照组比较，Ad-TGF-β1组CD36和SR-A1蛋白表达均明显低于；而Ad-TGF-β1+siRNA CEH组和siRNA CEH组CD36和SR-A1蛋白表达明显增强。结论TGF-β1是通过提高CEH的表达来抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化。

关键词〔〕转化生长因子-β1; 胆固醇酯水解酶；CD36；清道夫受体A1

中图分类号〔〕R581；R54〔文献标识码〕A〔

基金项目：辽宁省自然科学基金(2013022010)；辽宁医学院青年科技启动

通讯作者：罗俊生(1968-)，男，博士后，主任医师，主要从事动脉粥样硬化研究。。

第一作者：张凤香(1978-)，女，博士，副主任医师，主要从事动脉粥样硬化研究。

动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病的主要病理学基础，而巨噬细胞转化为泡沫细胞是 AS 形成的关键环节。因此，抑制巨噬细胞源性的泡沫细胞形成是预防AS 形成的重要步骤。转化生长因子(TGF)-β1是一种具有多种生物学功能的生长因子,当TGF-β1在巨噬细胞中的表达发生变化时可以影响巨噬细胞向泡沫细胞的转化〔1〕。但目前TGF-β1影响巨噬细胞转化为泡沫细胞的具体机制尚不得而知。前期研究证明，在巨噬细胞内TGF-β1的表达与CEH的表达呈正相关。本文探讨TGF-β1能否通过CEH来影响巨噬细胞向泡沫细胞的转化。

1材料和方法

1.1 材料THP-1人单核巨噬细胞购自中国科学院上海生物研究所细胞库;ox-LDL购自北京生物技术公司;胎牛血清和胰蛋白酶购自碧云天公司; 兔抗鼠SR-A单克隆抗体、兔抗鼠和CD36单克隆抗体、小鼠抗β-actin 单克隆抗体、PCR试剂盒、HRP 标记山羊抗小鼠二抗均购自北京中杉金桥公司；羊抗兔二抗购自Jackson IR Labs公司;逆转录试剂盒购自大连宝生物公司；人源重组腺病毒载体Ad-TGF-β1购自Gibco公司；siRNA CEH购自QIAGEN公司。

1.2 诱导巨噬细胞泡沫化形成及分组冻存的人 THP-1 单核细胞置于 37℃水浴中 1 min 内快速复苏，培养于 含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，于 37℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中静置培养，每隔 3～5 d传代1次，细胞密度为1×106个/ml。取对数生长期的细胞，然后加入ox-LDL(100 mg/L)共同培养48 h,诱导泡沫细胞形成。将诱导的泡沫细胞分为4组：①空白对照组；②Ad-TGF-β1组;③Ad-TGF-β1+siRNA CEH组；④siRNA CEH组，再培养48 h，随后收集细胞。

1.3 油红O染色及脂质染色的半定量分析将油红 O 储存液与蒸馏水按 3∶2 比例混合，静置 5 min 后双层滤纸过滤(全过程避光)；将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)液洗2遍，吸干水分；室温下 10%甲醛固定 30 min；用配制好的油红染液避光染 40 min；60%异丙醇洗脱10 s；用蒸馏水洗去异丙醇，封片。 根据细胞脂滴的面积进行细胞分类;细胞脂滴的面积小于细胞核的面积记为“-”;细胞脂滴的面积≥细胞核的面积记为“+”,即为油红O染色细胞;每块玻片计数100个细胞。

1.4 高效液相色谱分析(HPLC)分析细胞内胆固醇含量待细胞处理结束后,弃去培养基,PBS液洗3遍;加入1 ml 0.9% NaCl溶液重新稀释细胞,反复冻融,冰浴中超声裂解细胞(600 W,20 s)。4℃、10 000 r/min离心15 min,辛可酸液进行蛋白定量;将细胞溶解产物分为等体积的两组;加入等体积的新鲜配制的15%KOH醇溶液,室温涡旋至细胞溶解产物清亮;分别加入6%的三氯乙酸去蛋白。 再加入等体积的正己烷∶异丙醇溶液(4∶1,V/V),将混合物涡旋5 min;1 500 r/min速度离心 5 min。收集上层有机相;将下层水相按上述方法重复抽提 2次; 将混合的有机相在真空冷冻干燥机中干燥,在室温冷却;加入100 μl异丙醇∶正庚烷∶乙腈(35∶12∶52,V/V) 将样本溶解,活性炭去色素;超声除气 5 min,1 500 r/min离心 5 min,收集上清液;取10 μl进样,进行HPLC分析，检测胆固醇酯(CE)、游离胆固醇(FC)、总胆固醇(TC)。

1.5 Western印迹法检测裂解细胞提取细胞总蛋白,BCA试剂盒定量。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒压电转移至硝酸纤维素膜,5%脱脂牛奶封闭1 h,清道夫受体(SR)-A(1∶500) 和CD36(1∶1 000)37℃孵育2 h,TBST洗膜3次，每次10 min，后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶500)，4℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL发光试剂盒发光显影，凝胶成像。

1.6 统计学方法采用SPSS13.0软件进行正态性和方差齐性检验，两样本的均数比较采用t检验。

2结果

2.1 Ad-TGF-β1和(或)siRNA CEH对巨噬细胞泡沫化的影响空白对照组阳性细胞数量为59.54±4.01、Ad-TGF-β1组阳性细胞数量为15.12±1.23、Ad-TGF-β1+siRNA CEH组阳性细胞数量为89.01±3.67、siRNA CEH组阳性细胞数量为94.28±5.22。与空白对照组比较,Ad-TGF-β1+siRNA CEH组和siRNA CEH组阳性细胞数量明显增加(P<0.05)，但Ad-TGF-β1+siRNA CEH组和siRNA CEH组阳性细胞数量无明显差异(P>0.05)；而Ad-TGF-β1组阳性细胞与空白对照组比较阳性细胞数量明显降低(P<0.05)。见图1。

2.2 Ad-TGF-β1和/或siRNA CEH对巨噬细胞内胆固醇代谢的影响HPLC检测结果显示：与空白对照组比较，Ad-TGF-β1+siRNA CEH组和siRNA CEH组巨噬细胞内CE、FC和TC含量均增加(P<0.05)；而Ad-TGF-β1组与空白对照组比较巨噬细胞内CE、FC和TC含量均明显下降 (P<0.05)。说明Ad-TGF-β1可以减少CE在细胞内聚集并加强FC的流出(均P<0.05)。见表1。

2.3 Ad-TGF-β1和(或)siRNA CEH对巨噬细胞中CD36和SR-A1蛋白表达的影响见图2。Ad-TGF-β1组CD36和清道夫受体(SR)-A1蛋白表达均明显低于空白对照组；而Ad-TGF-β1+siRNA CEH组和siRNA CEH组CD36和SR-A1蛋白表达明显高于空白对照组(P<0.05)。

图1　油红O染色显示各组巨噬细胞泡沫化情况(×400)

组别CE(mg/ml)FC(mg/ml)TC(mg/ml)CE/TC(%)空白对照组50.17±3.1137.21±1.0376.23±4.2565.76±2.37Ad-TGF-β1组11.57±2.011)9.58±1.021)42.59±2.351)27.10±2.011)Ad-TGF-β1+siRNACEH组79.54±5.021)52.65±3.121)98.16±4.231)81.03±2.121)siRNACEH组86.21±3.251)59.06±2.541)106.01±5.221)81.31±3.041)

与空白对照组比较：1)P<0.05

1.siRNA CEH 组;2.Ad-TGF-β1 组;3.Ad-TGF-β1+siRNA CEH组;4.空白对照组 图2　Western印迹检测各组巨噬细胞CD36和 SR-A1蛋白表达的影响

3讨论

泡沫细胞的形成是AS的显著特征。血液系统中的单核巨噬细胞迁移到血管内皮下吞噬大量脂质后形成泡沫细胞,泡沫细胞释放的CE和FC在血管壁损伤处大量聚集形成了AS斑块脂质核心。近来研究表明,CEH介导的细胞内CE水解作用,能够促进CE水解为FC,并促进FC外流到细胞外受体,从而同时减少了细胞内CE和FC的聚集〔2〕。 TGF-β1属TGF-β超家族，是一种分子量为25 000 kD的多肽,是由巨噬细胞、血小板、血管内皮及平滑肌细胞等分泌,在AS发生、发展过程中起重要作用〔3〕。研究表明巨噬细胞摄取脂蛋白和巨噬细胞泡沫化转化的形成与巨噬细胞TGF-β1浓度呈负相关，但其具体机制尚不清楚〔4〕。本研究结果说明增加TGF-β1的表达可以有效抑制细胞泡沫化,减少CE在细胞内聚集并加强FC的流出,抑制泡沫细胞的形成。但当沉默CEH的表达时TGF-β1这种抑制泡沫细胞形成的作用却被明显降低。巨噬细胞可以表达多种SRs,包括SR-A、SR-BI、CD36、CD68及磷脂酰丝氨酸和氧化脂蛋白的SR，其中CD36和SR-A被认为是主要的致AS受体，在AS的形成过程中起重要作用〔5～7〕。研究证实，SR-A、CD36介导的胆固醇流入直接影响了巨噬细胞转化为泡沫细胞的程度〔8，9]。同时研究还发现，TGF-β1能通过影响SR-A和CD36的表达来抑制AS的发生、发展过程，但具体机制尚不清楚〔10，11〕。本实验结果说明，TGF-β1可能是通过CEH来影响CD36和SR-A1的表达的。综上，TGF-β1可能是通过CEH来影响巨噬细胞的泡沫化进程。

4参考文献

1Maclellan WR，Brand T，Schneider MD．Transforming growth factor-β1 in cardiac ontogeny and adaption〔J〕．Circ Res,2000；73(2)： 783-91.

2Ghosh ST,Clair RW,Rudel LL.Mobilization of cytoplasmic CE droplets by over-expression of human macrophage cholesteryl ester hydrolase〔J〕.J Lipid Res,2003; 44(6):1833-40.

3Zuckerman SH,Panousis C,Evans G. TGF-beta reduced binding of high-density lipoproteins in murine macrophages and macrophage-derived foam cells〔J〕.Atherosclerosis,2001;155(1):79-85.

4Erren M ,Reinecke H ,Junker R,etal.Systemic inflammatary parameters in patients with atherosclerosis of the coronary and peripheral arteries〔J〕.Artorisclor Thromb Vasc Biol,1999;19(3):2355-63.

5Silverstein RL，Li W，Park YM，etal．Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36：implications in atherosclerosis and thrombosis〔J〕．Trans Am Clin Climatol Assoc，2010;121(7)：206-20.

6Collot TS，Martin J，Mcdermott RC，etal． CD36 and macrophages in atherosclerosis〔J〕．Cardiovasc Res，2007;75(3)：468-77.

7黄汉鹏，庄燕，柏惠，等．ERK 信号通路参与内质网应激时由 A 类清道夫受体介导的细胞凋亡〔J〕． 南京医科大学学报(自然科学版)，2010;30(6)：731-5.

8Shashkin PB,Ley DK. Macrophage differentiation to foam cells〔J〕.Curr Pharm Res,2005; 11(23):3061-72.

9Cuchel MD， Rader J. Macrophage reverse cholesterol transport:key to the regression of atherosclerosis〔J〕.Circulation,2006; 113(21): 2548-55.

10Tsukamoto K,Kinoshita M,Kojima K,etal. Synergically increased expression of CD36,CLA-1 and CD68,but not of SR-A and LOX-1,with the progression to foam cells from macrophages〔J〕.J Atheroscler Thromb,2002; 9 (1):57-64.

11Yang YL,Lin SH,Chuang LY,etal. CD36 is a novel and potential anti-fibrogenic target in albumin-induced renal proximal tubule fibrosis〔J〕.J Cell Biochem,2007;101 (3):735-44.

〔2013-12-09修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)