类叶升麻苷在体内诱导血红素加氧酶-1的表达

类叶升麻苷在体内诱导血红素加氧酶-1的表达

王洪权王玉敏1崔其福赵伟丽1王丽娜

(赤峰学院医学院赤峰学院附属医院神经内科，内蒙古赤峰024005)

摘要〔〕目的探讨类叶升麻苷(AS) 是否在体内诱导血红素加氧酶-1(HO-1)的表达。方法AS 12.5 mg/kg 和25 mg/kg以腹腔注射的方式给予SD大鼠，在特定时间处死大鼠，取大脑皮层和纹状体组织以及肾脏和肝脏组织。提取组织蛋白，Western印迹方法检测HO-1。结果与正常对照组相比,AS可在皮层和纹状体中剂量依赖性诱导HO-1的表达上调，在外周肾脏和肝脏组织中AS剂量依赖诱导HO-1的表达上调。结论AS可在体内诱导HO-1的表达。

关键词〔〕类叶升麻苷；血红素加氧酶-1；神经退行性疾病；蛋白表达

中图分类号〔〕R741.05〔

基金项目：国家自然科学

Acteoside induced heme oxygenase-1 expression in vivo

WANG Hong-Quan，WANG Yu-Min，CUI Qi-Fu,etal.

Chifeng Medical College,Chifeng University,Chifeng 024005,Inner Mongolia,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate whether Acteoide(AS) induce Heme oxygenase-1(HO-1) expression in vivo.MethodsMale Sprague-Dawley rats(220～250 g) were treated with a single injection with 12.5,25 mg/kg body weight AS . Animals brain tissue were removed，and immunohistochemistry was carried out. Fresh brain，kidney and liver tissue were homogenized in lysis buffer，then the HO-1 levels were determined by Western blot.ResultsAS induced the expression of HO-1 in a concentration-dependent in rat cortex and striatum,also in liver and kidney.ConclusionsAS could induce Heme HO-1 expression in vivo.

【Key words】Acteoside;Heme oxygenase-1;Neurodegenerative disease;Protein expression

1肿瘤内科

第一作者：王洪权(1979-)，男，博士,副教授，主治医师，主要从事神经退行疾病发病机制及其防治的临床与基础研究。

血红素加氧酶-1(HO-1)通过抗氧化损伤作用而发挥其神经保护作用〔1〕。大量研究表明，体内活性氧(ROS)产生增加或ROS清除能力的减低，从而破坏氧化还原稳态，最终导致细胞内总的ROS增加或氧化应激(OS)的发生。在OS状态下，过多的ROS持续不断地攻击脂质、蛋白质和DNA，导致严重不可逆的氧化损伤。OS参与许多疾病的病理机制。包括神经退行性疾病〔2〕。 因此目前筛选出能够上调HO-1表达的天然化合物成为氧化应激损伤的研究热点〔3，4〕。本研究探讨天然抗氧化剂类叶升麻苷(AS)是否能够在体内上调HO-1的表达。为探讨AS作为治疗神经退行性疾病治疗奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器HO-1抗体(#SPA895) 购自Stressgen公司,AS购自Winherb Medical Technology Inc，免疫印迹化学发光试剂(ECL)购自Santa cruz公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自Millpore公司。Western印迹电泳仪(Bio-Rad公司),酶标仪(Bio-Rad公司),多用脱色摇床(上海新波无线电厂),超纯水净化仪(Millipore公司) ,倒置相差显微镜(日本Nikon公司)。

1.2Western印迹按照文献方法进行〔4,5〕用冷磷酸盐缓冲液(PBS)收集处理好的培养细胞，用RIPA 裂解液匀浆提取蛋白为总蛋白。10%+二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)凝胶电泳，将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至PVDF膜上，放入含5%脱脂奶粉的盐酸缓冲液(TBS)中平衡2 h；在膜上滴加一抗，室温，翻转摇床上作用2 h，然后移至4℃冰箱中过夜；TBST漂洗3次，15 min/次；在膜上滴加抗兔辣根过氧化物酶-IgG二抗(1∶5 000)，室温，翻转摇床上作用1 h；TBST漂洗3次，15 min/次；ECL荧光显影液加膜上反应，暗室内正面朝下盖于X线胶片上，分别曝光，胶片显影，定影。结果用图像分析软件(Quantity One) 进行灰度值定量分析。以β肌动蛋白作为内参照，计算待测蛋白条带积分吸光度与β肌动蛋白的比值，表示待测蛋白的相对表达水平。

1.3统计学方法采用GraphPad Prism 4.0 software软件进行t检验及单因素方差分析。

2结果

2.1AS在皮层和纹状体上调HO-1蛋白的表达动物腹腔注射AS(25 mg/kg) 6 h后处死动物，提取大脑皮层和纹状体组织，提取蛋白。免疫印记显示，AS可在大脑皮层和纹状体组织诱导HO-1的表达。AS可以在神经系统内诱导HO-1的表达，同时也表明AS可通过血脑屏障进入大脑内。见图1，图2。

2.2AS在肝脏和肾脏诱导HO-1蛋白的表达动物腹腔注射AS(25 mg/kg)6 h后处死动物，提取肝脏和肾脏组织蛋白。免疫印记显示，AS同样也可在肝脏和肾脏组织诱导HO-1的表达。这表明，AS也可在外周组织中上调HO-1的表达。见图3，图4。

图1　AS诱导大脑皮层HO-1表达

图2　AS诱导纹状体HO-1表达

图3　AS诱导肝脏HO-1表达

图4　AS诱导肾脏HO-1表达

3讨论

HO-1在体外培养细胞和体内均具有神经保护作用。 各种毒性刺激因素作用于神经或非神经脑细胞后，HO-1的表达上调，进而参与对氧化应激损伤的抑制作用。因此，筛选出能够上调HO-1表达的天然抗氧化剂成为近年的研究热点。研究显示AS具有许多药理学活性，具有肝保护活性、抗凋亡活性和抗氧化活性〔6～8〕。最近研究表明AS具有神经保护活性，其可以抑制1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)和谷氨酸诱导的神经损伤〔9,10〕。另外，AS也可抑制鱼藤酮致SH-SY5Y细胞损伤〔11〕，并在MPTP所致的帕金森病小鼠模型具有神经保护作用〔12〕。AS可降低tau蛋白的磷酸化而在冈田酸诱导的阿尔茨海默病细胞模型中发挥其神经保护作用〔13〕。目前AS的保护作用机制主要集中在其抗氧化〔14〕、抗凋亡活性〔7〕。其药理学活性机制有待于进一步深入研究。本研究表明，AS可以在神经系统内诱导HO-1的表达，同时也表明AS可通过血脑屏障进入大脑内。而且AS也可在外周组织中上调HO-1的表达。

综上所述，鉴定出AS为一个新的诱导HO-1表达的化合物。本研究阐明了AS的新的药理作用，为进一步探讨其神经保护作用机制奠定了前期的基础。

4参考文献

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13白鹏,彭晓明,高莉,等.类叶升麻苷对冈田酸诱导的阿尔茨海默病细胞模型的保护作用研究〔J〕.中国中药杂志,2013;38(9):1323-6.

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〔2013-09-15修回〕

(编辑袁左鸣)