低氧诱导因子-1α对老年骨关节炎软骨细胞活性的影响

2015-12-29 03:22叶晖,林其仁,吴文华
中国老年学杂志 2015年2期
关键词:滑膜骨关节炎免疫组化

低氧诱导因子-1α对老年骨关节炎软骨细胞活性的影响

叶晖林其仁吴文华林小斌林晓聪

(福建医科大学附属第二医院,福建泉州362000)

摘要〔〕目的探讨低氧诱导因子(HIF)-1α与老年骨关节炎(OA)软骨细胞增殖和凋亡的关系。方法选择老年OA患者84例,另选健康人群80例作为对照。免疫组织化学方法检测HIF-1α、bcl-2蛋白和增殖细胞核抗原(PCNA)在OA和正常软骨细胞中的表达,分析其对OA软骨细胞增殖和凋亡的影响。结果OA组HIF-1α阳性表达率为83.9%,明显高于正常对照组(χ2=30.312,P=0.000)。正常软骨细胞中bcl-2蛋白表达量明显高于OA软骨细胞。TUNEL法检测细胞凋亡结果显示,OA软骨组中细胞凋亡碎片明显多于正常软骨细胞,正常组软骨细胞凋亡指数为7.16±9.01,而OA组软骨细胞凋亡指数为39.7±7.23,两者差异显著(P<0.05)。PCNA计数,OA组中软骨细胞增殖活性明显低于正常组。结论HIF-1α表达与OA软骨细胞活性密切相关,可能通过调控bcl-2蛋白及PCNA影响软骨细胞的增殖与凋亡。

关键词〔〕骨关节炎;低氧诱导因子-1α;软骨细胞

中图分类号〔〕R68〔

基金项目:福建省卫生厅青年基金(2010-2-62);泉州市科技计划(2010Z36)

通讯作者:林其仁(1956-),男,主任医师,教授,主要从事关节外科、创伤骨科的临床与基础研究。

第一作者:叶晖(1975-),男,副主任医师,硕士,主要从事关节外科、创伤骨科的临床与基础研究。

骨关节炎(OA)发病年龄逐步年轻化〔1〕。目前尚缺乏从根本上控制和治疗OA的有效方法。OA发病机制至今尚不十分清楚,涉及全身及局部的许多因素,可能是一种综合的机制。OA的重要病理特征是关节软骨的降解〔2〕,软骨细胞凋亡在其中起到关键作用〔3〕。本研究利用本院病例资源探讨低氧诱导因子(HIF)-1α等对OA软骨保护作用及其机制,并探讨其与OA软骨细胞增殖与凋亡的相关性,为临床老年OA诊治提供一定的理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料选取我院2011年2月至2013年2月就诊的已经病理确诊的84例老年OA患者和80例同年龄、无关节病史及肉眼病变并行手术治疗者为对照。实验组男51例,女33例,年龄61~87岁,平均(63.7±1.1)岁;对照组男44例,女36例,年龄63~86岁,平均(65.2±1.4)岁;均经过临床确诊,且无其他心血管或神经系统等严重疾患。三组患者的性别、年龄等比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2标本采集方法OA软骨标本取自膝关节表面置换术中切下的OA患者胫骨平台软骨。同时收集无关节疾病史及肉眼病变的因外伤截肢、交叉韧带断裂、盘状软骨损伤与半月板损伤等行手术治疗的膝关节组织,所有病例均经临床和病理确诊关节无病变,作为正常对照组。

1.3免疫组化方法所取新鲜标本均以10%中性甲醛液固定48 h,关节软骨10%EDTA脱钙6、7 w,常规脱水,石蜡包埋,以4~5 μm厚度连续切片。行常规HE染色外按试剂盒内说明分别行HIF-1α、bcl-2及PCNA免疫组化与细胞凋亡染色,用已知的阳性切片作为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。采用免疫组织化学PicTureTM通用型二步法,具体步骤按说明书进行。兔抗HIF-1α抗体(1∶200)购自武汉博士德公司。鼠抗人PCNA和bcl-2抗体工作液为北京中山试剂公司产品。PV6000通用型试剂盒购自美国Zymed公司。

1.4免疫组化结果判断方法HIF-1α染色结果阳性判断标准:HIF-1α蛋白以细胞核或胞浆内有棕黄色细颗粒为阳性。在高倍镜下(×400)对每张切片随机选择5个视野,计数200个细胞/视野,共计1 000个,阳性细胞数≤10%为阴性(-),>10%为阳性(+)。bcl-2蛋白染色阳性结果判断:bcl-2蛋白主要位于细胞质内,呈棕黄色细颗粒状。以阳性细胞占切片中软骨细胞总数的5%以上为阳性(+),≤5%为阴性(-)。PCNA染色结果及分级:PCNA阳性信号分布于细胞核,棕黄色颗粒状阳性细胞≤25%为Ⅰ级,26%~50%为Ⅱ级,51%~75%为Ⅲ级,≥76%为Ⅳ级。将Ⅰ、Ⅱ级定为低增殖活性,Ⅲ、Ⅳ级定为高增殖活性,以此作为OA软骨细胞增殖程度的指标。

1.5细胞凋亡结果判断用TUNEL法标记过氧化物酶显色检测细胞凋亡,阳性细胞(凋亡细胞)呈棕褐色,核浓缩、边集,大小不等,有时呈半月形,有时核碎裂成碎片,最终胞质也发生碎裂。每张切片连续选取5个高倍(×200)视野,计算平均凋亡细胞所占细胞总数的百分比即为凋亡指数(AI)。

2结果

2.1滑膜HE染色光镜观察情况正常滑膜下层由含有较多脂肪组织及纤维网状组织构成的疏松结构,其内层由2~3层滑膜细胞组成,排列疏松,内层滑膜细胞包裹于基质中。基质层可见纤维排列整齐,由内向外逐渐增多,仅见少量滑膜成纤维细胞及淋巴细胞;滑膜下层结构疏松,含有较多的脂肪组织及纤维网状组织。见图1。OA滑膜可见明显炎性细胞浸润,滑膜退变明显,可见多量微血管形成,滑膜结构明显改变、紊乱,其间可见多数脂肪细胞浸润,图1。

OA滑膜

2.2两组人群软骨细胞中HIF-1α表达情况两组人群软骨细胞经免疫组化染色后,HIF-1α表达阳性颗粒主要见于细胞核及胞质中,OA组HIF-1α阳性表达率为83.9%,而正常对照组中未见明显HIF-1α阳性表达,差异有统计学意义(χ2=30.312,P=0.000)。见图2。

正常软骨细胞

OA软骨细胞

2.3两组软骨细胞凋亡情况免疫组化结果显示,正常软骨细胞和OA软骨细胞中均有bcl-2蛋白表达,但正常软骨细胞中bcl-2蛋白表达量明显高于OA软骨细胞(P<0.05)。TUNEL法检测细胞凋亡结果显示,正常组软骨细胞凋亡指数为7.16±9.01,而OA组软骨细胞凋亡指数为39.7±7.23,两者差异显著(P<0.05)。见图3。

正常软骨细胞bcl-2

OA软骨细胞bcl-2

OA组细胞凋亡

正常组细胞凋亡

2.4两组软骨细胞增殖情况通过免疫组化PCNA计数,OA组中软骨细胞增殖低增殖活性62例,高增殖活性22例。而正常健康组中高增殖活性有59例,低增殖活性21例,两者相比差异显著(P<0.05),OA组Ⅰ级36例,Ⅱ级26例,Ⅲ级18例,Ⅳ级4例;健康组Ⅰ级12例,Ⅱ级9例,Ⅲ级43例,Ⅳ级16例。见图4。

正常组

OA组

3讨论

OA最主要的病理特征是关节软骨的退行性变化。OA涉及整个滑膜关节,包括软骨、滑膜及软骨下骨,这些组织的细胞都有相对独立的启动能力并引起OA的发生,其最后通路都是关节软骨的破坏、关节的重塑及软骨下的骨质硬化〔4〕。目前对于其具体发病机制仍未完全明了。临床上OA的治疗主要是缓解关节疼痛、改善功能以及人工关节置换术,而缺乏一种从软骨破坏和骨赘形成这些OA发生的关键原因着手的根本性治疗方式〔5〕。随着研究进展,国内外许多学者对OA关节软骨组织学研究发现有软骨细胞减少,而软骨细胞凋亡在其中起到关键作用〔6〕。

膝关节是人体最大的滑膜关节,也是骨关节炎发病率最高的关节。大量研究显示关节腔内为低氧环境,表层关节软骨周围氧浓度约为空气中氧的6%~10%,深层的软骨细胞接受仅约1%~6%的氧浓度,甚至更少〔7〕。本研究从膝关节取材。正常关节软骨滑膜组织HE染色区呈白色或淡黄色,表面光滑而具有光泽,软骨细胞较致密而均匀。而在OA软骨细胞数目减少稀疏,表面粗糙不光滑,无光泽有些甚至出现裂隙,且存在较多空泡细胞。利用免疫组化染色方法探究HIF-1α、bcl-2蛋白和PCNA在正常膝关节软骨细胞和OA患者膝关节软骨细胞中的表达差异,并通过软骨细胞增殖和凋亡活性的不同反应HIF-1α对软骨细胞活性的调控功能。HIF-1α是受氧浓度调节的重要因子,当氧浓度低于6%时,HIF-1α表达会成倍增加并迅速达到最大值,然后其转入核内与HIF-1β形成稳定的结构,当发生OA时,膝关节内部缺氧状态更明显,促使HIF-1α表达持续增加,因此其在OA发生发展中的重要地位无可否认。

bcl-2蛋白是目前已知的最重要的抗凋亡因子〔8〕。bcl-2蛋白分布在线粒体外膜的浆膜面、核膜和内质网表面,对于稳定线粒体膜有着重要的作用,同时还可作用于线粒体通透转运孔的有关蛋白以维持线粒体的跨膜电位。此外,bcl-2可能是阻止DNA损伤激活的凋亡信号到达它的靶位,从而打断了凋亡感应子和效应子阶段的联系〔9〕。本文表明HIF-1α可能通过bcl-2蛋白调控软骨细胞的凋亡,从而影响OA的发生发展。

PCNA与细胞DNA合成关系密切,在细胞增殖的启动上起重要作用,是反映细胞增殖状态的良好指标。PCNA是一种分子量为36 kD的蛋白质,在细胞核内合成,并存在于细胞核内,为DNA聚合酶表达活性时的辅助蛋白。免疫组化检测软骨细胞PCNA的表达可以反映软骨细胞的增殖状况。

综上,HIF-1α对OA软骨细胞增殖和凋亡起很大作用,其可能通过调控bcl-2蛋白和PCNA的表达量影响软骨细胞活性。

4参考文献

1Ruiz-Romero C,Blaneo FJ.Proteomics role in the search for improved diagnosis,prognosis and treatment of osteoarthritis〔J〕.Osteoarthritis Cartilage,2010;18(4):500-9.

2Saito T,Fukai A,Mabuehi A,etal.Transcriptional regulation of endochondral ossification by HIF-2α during skeletal growth and osteoarthritis development〔J〕.2010;16(6):678-86.

3李笑颜,赵建,曾文,等.晚期骨关节炎患者关节软骨细胞中HIF-1α和VEGF的表达〔J〕.上海交通大学学报:医学版,2010;30(7):812-6.

4Lafont JE,Talma S,Hopfgarten C,etal. Hypoxia promotes the differentiated human articular chondrocyte phenotype through SOX9-dependent and- independent pathways〔J〕.J Biol Chem,2008;283(8):4778-86.

5Ray BK,Shakya A,Ray A.Vascular endothelial growth factor expression in arthritic joint is regulated by SAF- 1 transcription factor〔J〕.J Immunol,2007;178(3):1774-82.

6Pfander D,Swoboda B,Cramer T.The role of HIF- 1alpha in maintaining cartilage homeostasis and during the pathogenesis of osteoarthritis〔J〕.Arthritis Res Ther,2006;8(1):104.

7徐卫东,吴岳篙,张春才.骨关节炎的诊断与治疗〔M〕.第2版.上海:第二军医大学出版社,2004:10.

8Akhavani MA,Madden L,Buyssehaert I,etal.Hypoxia upregulates angiogenesis and synovial cell migration in rheumatoid arthritis〔J〕.Arthritis Res Ther,2009;11(3):R64.

9张振,王君,吕苗苗,等.大鼠低氧诱导因子-1.基因克隆和表达载体的构建〔J〕.现代生物医学进展,2010;(14):1101-3.

〔2013-12-13修回〕

(编辑李相军)

猜你喜欢
滑膜骨关节炎免疫组化
基于滑膜控制的船舶永磁同步推进电机直接转矩控制研究
抗抑郁药帕罗西汀或可用于治疗骨关节炎
高层建筑施工中的滑膜施工技术要点探讨
免疫组化病理技术及质量控制方式的研究
骨关节炎患者应保持适量运动
夏枯草水提液对实验性自身免疫性甲状腺炎的治疗作用及机制研究
血糖血脂对骨关节炎的影响
婴幼儿原始黏液样间叶性肿瘤一例及文献复习
结直肠癌组织中SOX9与RUNX1表达及其临床意义
关节镜在膝关节滑膜软骨瘤病诊治中的应用