流式细胞术检测血小板相关抗体在特发性血小板减少性紫癜诊治中的意义

刘明伟，王飞

（佛山市第一人民医院，广东528000）

流式细胞术检测血小板相关抗体在特发性血小板减少性紫癜诊治中的意义

刘明伟，王飞

（佛山市第一人民医院，广东528000）

目的探讨流式细胞术检测血小板相关抗体在小儿特发性血小板减少性紫癜（ITP）诊治中的临床意义。方法选择2012年1月1日至2013年12月31该院儿科住院部收治的临床诊断为ITP的患儿50例，常规检查血小板计数，并采用流式细胞术检测血小板相关抗体（PAIgG、PAIgA、PAIgM），观察PAIgG、PAIgA、PAIgM与血小板计数的相关性。经治疗2周后，分别比较不同治疗效果的患儿治疗前后各血小板相关抗体的表达水平。结果所有患儿PAIgG、PAIgA、PAIgM表达水平与血小板计数之间均呈负相关（γ=-0.71、-0.66、-0.82，P＜0.05）。疗效满意患儿治疗后各血小板相关抗体表达水平较治疗前明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；疗效不佳患儿治疗后各血小板相关抗体表达水平较治疗前降低不明显，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论血小板相关抗体可作为ITP诊断的辅助指标，同时检测治疗前后的变化可用于评估预后及病情监测；流式细胞术可快速、有效、准确地测定血小板相关抗体的表达水平。

血小板/免疫学；血小板计数；紫癜，血小板减少性，特发性；流式细胞术

特发性血小板减少性紫癜（ITP）是小儿最常见的一种免疫性出血性疾病，主要是由于患儿产生了抗血小板自身抗体而引起血小板破坏过多，并抑制巨核细胞产生血小板，引起皮肤、黏膜出血[1-2]。该病的发病与免疫机制有关，血小板相关抗体起着极其重要的作用，因此，血小板相关抗体检测在ITP的诊断中具有较高的价值。与其他检测方法相比，流式细胞术有灵敏度高，所需标本量少，分辨率高，方法快捷、准确等优点[3]。因此，本研究的意义在于采用流式细胞术检测ITP患儿血液中血小板相关抗体表达水平，探讨上述指标在该病诊断及治疗中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2012年1月1日至2013年12月31日本院儿科住院部收治的临床诊断为ITP的患儿50例为研究对象，其中男29例，女21例；年龄最大12岁，最小2个月。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法（1）如患儿血小板计数大于或等于20×109L-1，无内脏出血体征，给予甲泼尼龙注射液2 mg/（kg·d）治疗，待血小板升至正常后改为甲泼尼龙片2 mg/（kg·d）口服，治疗2周时复查血小板计数及血小板相关抗体。（2）如患儿血小板计数小于20×109L-1，或有内脏出血体征，则给予大剂量甲泼尼龙20mg/（kg·d），最大剂量不超过1 g，治疗3 d后改为甲泼尼龙片2 mg/（kg·d）口服，同时加用丙种球蛋白400 mg/（kg·d），连用5 d，治疗2周时复查血小板计数及血小板相关抗体表达水平。

1.2.2 检测方法入院后常规检查血小板计数，并采用流式细胞术[FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）]检测血小板相关抗体表达水平，包括PAIgG、PAIgA、PAIgM，具体方法如下。（1）血小板的富集：ACD抗凝血1 mL，150×g离心5 min，取上清液400 g离心10 min，PBS洗2次后，悬浮细胞，调整细胞浓度为5×106mL-1。（2）直接免疫标记：取4支试管，分别加入4种免疫球蛋白抗体及CD61-PE、100 μL血小板悬液，室温孵育30 min，PBS洗1次，置4℃冰箱待测。（3）流式细胞仪分析：FACS Calibur流式细胞仪氩离子激光器，激发波长488 nm，使用软件CellQuest。在CD61/SSC散点图中，圈出CD61+血小板细胞群体，收集并分析此群体细胞20 000个。根据CD61设门，以阴性对照管调整电压，然后检测标本PAIgG、PAIgA、PAIgM。

1.2.3 疗效判定疗效满意：出血症状消失，持续至治疗足2周时血小板计数大于50×109L-1；疗效不佳：出血症状减轻，但至治疗足2周时血小板计数小于50×109L-1。

1.2.4 观察指标观察所有患儿血小板相关抗体表达水平及血小板计数；分别比较疗效满意和疗效不佳患儿治疗前后血小板相关抗体的表达水平。

1.3 统计学处理应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，经验证样本资料均符合正态分布且方差齐性后采用t检验、方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义，用直线回归相关分析比较两因素之间的相关性。

2 结果

2.1 治疗效果疗效满意患儿共39例，其中年龄最大10岁，最小2个月；男21例，女18例。疗效不佳患儿共10例，其中年龄最大12岁，最小2岁；男7例，女3例；另有1例男性患儿治疗未足2周，自动出院。

2.2 ITP患儿治疗前PAIgG、PAIgA、PAIgM表达水平与血小板计数的相关性所有患儿PAIgG、PAIgA、PAIgM表达水平与血小板计数之间均呈负相关（γ=-0.71、-0.66、-0.82，P＜0.05）。

2.3 不同疗效患儿治疗前后血小板相关抗体表达水平比较疗效满意患儿治疗后各血小板相关抗体表达水平较治疗前明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；疗效不佳患儿治疗后各血小板相关抗体表达水平较治疗前降低不明显，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同疗效患儿治疗前后血小板相关抗体表达水平比较（±s）

表1 不同疗效患儿治疗前后血小板相关抗体表达水平比较（±s）

注：与同组治疗前比较，aP＜0.05。

组别治疗满意组nPAIgGPAIgMPAIgA治疗不佳组时间治疗前治疗后治疗前治疗后39 39 10 10 36±18 12±5a39±17 32±4 33±8 11±4a36±7 21±3 15±10 12±4a18±9 15±3

3 讨论

ITP是一种获得性自身免疫性疾病，患儿体内产生了针对血小板和巨核细胞膜表面糖蛋白的自身抗体，过度破坏血小板的网状内皮系统或补体系统，从而使外周血血小板减少，临床上即表现为出血。ITP可分为急性和慢性，急性患儿半数以上于发病前3周内有病毒感染病史，起病迅速，主要表现为自发性皮肤与黏膜出血。根据血小板下降程度可分为轻度：血小板50×109～100×109L-1，只在创伤后出血；中度：血小板25×109～50×109L-1，尚无广泛出血不止；重度：血小板10×109～25×109L-1，见广泛或创伤处出血不止；极重度：血小板小于10×109L-1，自发性出血不止危及生命，甚至颅内出血[1]。

其发病机制尚不清楚，ITP患儿血小板相关抗体的异常表达说明由于自身血小板抗原变异，刺激机体在产生相应抗体的过程中，多株B淋巴细胞被激活而产生多种抗体，共同介导破坏血小板，从而引起血小板减少[2-3]。

目前国内该病的诊断主要依靠患儿的临床表现、血常规、骨髓检查并排除其他自身免疫性疾病及淋巴瘤、甲状腺功能亢进、肝脏疾病、脾功能亢进、药物等因素引起的继发性血小板减少症。然而骨髓穿刺检查，部分患儿家长不愿接受甚至抗拒，而血小板生存时间的测定操作复杂，难以在临床上广泛应用，因此，血小板相关抗体表达水平的检测在该病的诊断中显得尤为重要。本研究表明，绝大多数患儿中抗血小板抗体表达水平与血小板计数呈负相关，即抗血小板抗体水平越高，血小板减少的程度越严重，并且在有效治疗后各血小板相关抗体表达水平均显著下降，提示血小板相关抗体可作为ITP一个重要的诊断指标[4]。

本研究结果表明，疗效满意的ITP患儿体内的血小板相关抗体表达水平较治疗前明显下降，而疗效不佳的患儿血小板相关抗体表达水平较治疗前无明显改善，因此，可将血小板相关抗体作为指导临床治疗及监测病情的有效指标。作者认为，血小板相关抗体检测应作为ITP患儿的常规检测项目加以重视。

目前检测血小板相关抗体的方法有微柱凝胶技术、酶联免疫竞争抑制试验、流式细胞术、单克隆抗体特异性血小板抗原固定技术等。流式细胞术属第2代方法，与其他检测方法相比，流式细胞术具有以下优点：（1）所需采血量少，标本量少。（2）灵敏度高，即使血小板计数很低，也可分析；（3）分辨率高，可检测亚群表达及弱阳性。（4）方法准确，方便快捷。有研究表明，流式细胞术兼具快速、灵敏、简便的特点，对小儿ITP的诊断及病情监测均具有较好的实用价值[5-6]。但是，患有系统性红斑狼疮、骨髓异常增生综合征、B淋巴细胞增殖性疾病及Evan综合征（原发性血小板减少性紫癜并获得性溶血性贫血）等疾病的患儿，也可能出现血小板相关抗体阳性；如果血清中免疫复合物或免疫球蛋白增高也可以出现血小板相关抗体升高而产生假阳性；多次输血的患儿可因为同种免疫抗体吸附于血小板表面而导致血小板相关抗体的假阳性[7]。因此，目前尚不能完全依靠血小板相关抗体检测来诊断该病，与其他抗原特异性血小板抗体检测、改良抗原捕获ELISA法、血小板抗原单克隆抗体固相化法等特异性较高的方法联合应用，可提高血小板相关抗体检测的敏感性与特异性，从而进一步提高该病的免疫诊断水平[8-10]。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.05.034

:B

:1009-5519（2015）05-0726-02

2014-12-01）

广东省佛山市医学科学技术研究项目（2012014）。

刘明伟（1980-），女，广东佛山人，主治医师，主要从事儿科临床工作；E-mail：ssissycn@aliyun.com。

王飞（E-mail：wfei@fsyyy.com）。