苦参提取液对肠致病性大肠杆菌感染小鼠的疗效研究

吴蕊，余新超

（安徽理工大学医学院，安徽淮南232001）

苦参提取液对肠致病性大肠杆菌感染小鼠的疗效研究

吴蕊，余新超

（安徽理工大学医学院，安徽淮南232001）

目的研究苦参提取液对肠致病性大肠杆菌标准株O10（EPECO10）感染小鼠肠道的保护作用。方法将50只小鼠平均分为五组，每组10只，分别为模型组、治疗组Ⅰ（高浓度，含生药浓度为0.500 g/mL）、治疗组Ⅱ（中浓度，含生药浓度为0.250 g/mL）、治疗组Ⅲ（低浓度，含生药浓度为0.125 g/mL）及空白组。空白组小鼠腹腔注射生理盐水，其余四组小鼠腹腔注射EPECO10菌液建立腹泻模型，治疗组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ给予不同浓度的苦参灌胃，模型组和空白组用生理盐水灌胃。比较五组小鼠腹泻指数、炎症评分及肠道中超氧化物歧化酶（SOD）的含量。结果模型组小鼠的腹泻指数、炎症评分及肠道SOD的表达与治疗组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论苦参提取液可以明显减轻小鼠的腹泻症状，改善其肠道的病理表现，具有良好的治疗效果。

肠致病性大肠杆菌；腹泻；动物实验；超氧化物歧化酶；苦参

肠致病性大肠杆菌（EPEC）是造成小儿腹泻常见的条件致病菌，感染后的儿童（尤其是2岁以下的婴幼儿）可以出现持续性腹泻、腹痛，严重者可出现脱水而导致死亡。目前，临床上治疗由该菌引起的腹泻主要采用抗生素，其初期使用效果尚好，长期使用存在多种不良反应。为进一步探究中药对该病的治疗效果，本研究采用前期体外实验筛选出的对EPEC抑制作用较好的苦参，通过腹腔注射建立小鼠腹泻模型，观察该药在小鼠体内对EPEC的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料清洁级BALB／C小鼠50只（购自安徽医科大学实验动物中心），雌雄各半。致病性大肠杆菌标准株O10（EPECO10，购自北京北纳创联生物技术研究院），苦参（购自淮南恒康大药房），超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 实验菌液的制备将EPECO10经复壮培养后，增菌培养2～3代，挑选单个菌落接种于LB（溶菌肉汤）培养基中，置于37℃培养箱中培养18～24 h。采用平皿表面活菌计数法确定菌液浓度为5×109cfu/mL。

1.2.2 苦参液的制备称取苦参50 g，清洗、烘干、过筛、粉碎（程度以20目筛为宜），加水500 mL，将中药浸泡在水中，加热至沸腾后，改用文火再加热30 min，趁热将滤液滤出，再将滤渣加8倍水，二次煎煮30 min后将2次煎煮所得滤液合并在一起，水浴浓缩后，用100 mL容量瓶定容，装瓶后压橡胶和铝盖，流动蒸汽灭菌（压力为103.4 kPa）20 min后取出，复温至室温（22℃）条件下，置于4℃冰箱内冷藏备用。所得苦参水煎剂含生药浓度为0.500 g/mL。

1.2.3 动物分组及处理参照文献[1]方法，将50只小鼠均分为五组，每组10只，分别为模型组、治疗组Ⅰ（高浓度，含生药浓度为0.500 g/mL）、治疗组Ⅱ（中浓度，含生药浓度为0.250 g/mL）、治疗组Ⅲ（低浓度，含生药浓度为0.125 g/mL）及空白组。模型组，治疗组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ每只小鼠按体质量每10克腹腔注射制备好的0.2 mL EPECO10菌液建立腹泻模型[2]，空白组每只小鼠腹腔注射等体积生理盐水。模型组在注射EPECO10菌液4 h后用0.3 mL生理盐水灌胃，治疗组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在注射EPECO10菌液4 h后分别用0.3 mL高、中、低浓度苦参液灌胃，空白组在注射生理盐水4 h后用0.3 mL生理盐水灌胃。以上五组均为每12小时灌胃1次，连续给药3 d。

1.2.4 检测指标

1.2.4.1 临床指标参考文献[3]关于腹泻的评价指标，腹腔注射EPECO10菌液4 h后观察小鼠的精神状况、行为动作及大便情况；观察各组小鼠6 h内不同时间段稀便次数、总便次数、稀便级，计算稀便率和腹泻指数。（1）稀便率：每只动物所排稀便次数与总便次数之比。（2）稀便级：表示稀便的程度，以稀便污染滤纸形成污迹面积的大小分为4级。直径小于1 cm为1级，1～＜2 cm为2级，2～＜3 cm为3级，≥3 cm为4级。污迹为较规则圆形者测其直径，不规则形状则测量其最长和近似圆的直径，两数相加除以2。统计时先逐个测量每一堆稀便的级数，然后将该鼠所有稀便级数相加，除以稀便次数得每只小鼠稀便的平均级数，平均稀便级=稀便级数之和/稀便次数。腹泻指数=稀便率×平均稀便级。

1.2.4.2 病理指标实验结束前1 d禁食不禁饮。实验当天采用颈椎脱臼法处死全部小鼠，剖腹取幽门至回盲部小肠2 cm，10%中性甲醛中固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，行苏木素-伊红染色（HE染色），光镜下观察。判定炎症程度并评分[3]。正常（0分）：固有层无中性粒细胞浸润，间质无水肿。轻度（1分）：固有层少量中性粒细胞浸润，不浸润黏膜，间质轻度水肿；中度（2分）：固有层中等量中性粒细胞浸润，少量黏膜中有中性粒细胞浸润，间质中度水肿；重度（3分）：固有层大量中性粒细胞浸润，延及整个黏膜层，间质重度水肿甚至坏死。

1.2.4.3 小肠中SOD测定处死小鼠后剖腹取小鼠回盲部以上回肠组织8 cm，经冰盐水漂洗、滤纸吸干后制成10%组织匀浆，取上清液采用硝酸盐法测定肠道中SOD值，操作方法严格按试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组临床指标比较除空白组外，其余各组小鼠注射EPECO10菌液4 h后先后出现不同程度的腹泻，表现为倦怠、精神萎靡，肛周黏附黄色黏液便甚至稀便，内容物减少，食欲减退，部分小鼠出现毛发稀疏、凌乱。表明腹泻小鼠模型成功建立。与模型组比较，治疗组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ小鼠的腹泻症状均有所好转，稀便率降低，腹泻指数降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.2 各组病理指标比较空白组小鼠结肠组织结构清晰，黏膜完整。模型组小鼠结肠组织黏膜水肿、充血，肠绒毛排列欠整齐，上皮细胞脱落。经苦参灌胃后小鼠肠道组织黏膜水肿明显好转，其中治疗组Ⅰ、Ⅱ小鼠黏膜完整、肠绒毛排列整齐，未见明显上皮细胞脱落。治疗组Ⅲ小鼠肠道黏膜轻度水肿，但未见明显上皮细胞脱落。模型组小鼠肠道炎症评分明显高于空白组。治疗组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ小鼠肠道炎症评分明显高于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表1 各组临床指标比较（±s）

表1 各组临床指标比较（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.01。

组别模型组治疗组Ⅰ治疗组Ⅱ治疗组Ⅲ空白组n 稀便率（%）腹泻指数10 10 10 10 10 95.00±3.17 12.00±2.80 23.00±4.12 37.00±3.55 0.00±0.00 2.81±0.59 0.25±0.17a0.46±0.22a0.78±0.21a0.00±0.00

表2 各组病理指标比较（±s，分）

表2 各组病理指标比较（±s，分）

注：与模型组比较，aP＜0.01。

组别模型组治疗组Ⅰ治疗组Ⅱ治疗组Ⅲ空白组n 炎症评分10 10 10 10 10 2.83±0.33 0.65±0.58a1.30±0.48a1.50±0.53a0.00±0.00

2.3 各组小肠SOD水平比较治疗组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ小肠SOD水平与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。治疗组Ⅰ、Ⅱ小肠SOD水平与空白组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗组Ⅲ小肠SOD水平与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表3 各组小肠SOD水平比较（±s）

表3 各组小肠SOD水平比较（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.01；与空白组比较，bP＜0.01。

组别模型组治疗组Ⅰ治疗组Ⅱ治疗组Ⅲ空白组n SOD含量（nmol/mg pro）10 10 10 10 10 37.30±2.21 103.30±4.02a101.40±11.30a68.80±3.96ab118.59±8.99

3 讨论

EPEC相关性腹泻是一种常见的人畜共患性疾病，然而对于其致泻的致病机制、致病过程，迄今为止仍不是很清楚。目前，临床治疗由EPEC引起的相关疾病主要是以抗生素为主，但抗生素价格昂贵、不良反应大，随着抗生素的广泛应用，EPEC对多种抗生素表现出很强的耐药性，而且其耐药率有逐年升高的趋势。因此，不少学者试图从其他方面寻找有效的解决途径。苦参的有效成分为苦参碱，可以清热燥湿，能有效对抗炎性反应[4-5]，是常用的中药材之一。作者通过前期体外实验观察发现，苦参对EPEC有明显的抑制作用。本研究通过腹腔注射EPECO10菌液成功建立了小鼠腹泻模型，并发现苦参对腹泻小鼠的肠道保护作用，与相关研究报道一致[6-7]。通过比较不同浓度苦参液对小鼠腹泻指数及肠道炎症的影响，发现治疗组Ⅰ、Ⅱ疗效优于治疗组Ⅲ，但各组之间未发现明显差异，说明在低浓度时苦参液仍可以对小鼠的腹泻起到一定的保护作用。

SOD是一种超氧化物歧化酶，当组织中出现炎症时会产生大量的O2-，SOD可清除体内过多的O2-，保护细胞免受损伤，是常见的自由基清除酶，其活性高低可间接反映体内清除自由基的能力[8]。肠道发生炎症时，各种有害因子，如一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）等大量产生，消耗大量SOD，使得保护性因子SOD持续下降，随着炎症好转，SOD可明显升高[9]。本研究结果显示，在小鼠肠道炎症模型中，与模型组比较，治疗组Ⅰ、Ⅱ小肠SOD水平有明显增高，与相关研究报道一致[10-11]。治疗组Ⅲ小肠SOD水平增高不明显，分析其原因可能是药物浓度偏低，对肠道的保护作用不如高、中浓度，可见苦参对小鼠肠道的保护作用与其浓度呈正相关。

综上所述，苦参不仅具有明显的体外抑菌效果，而且在改善由EPEC引起的小鼠腹泻症状、保护肠道组织方面也存在一定的治疗价值。由于本实验条件有限，所使用EPEC为标准菌株，并未复制出临床菌株致泻的动物模型，因此，动物实验并不能说明临床问题，需要在今后的实验中进一步明确。

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Curative effect of sophora flavescens extraction in treatment of enteropathogenic E.coli of infected mice

Wu Rui，Yu Xinchao
（Anhui University of Science and Technology，Huainan，Anhui 232001，China）

ObjectiveTo approach the protection action of sophora flavescens extraction extraction on enteropathogenic E.coli standard strain O10（EPECO10）infecting mice intestinal tract.MethodsThe 50 mice were divided into five groups，10 of each group，including the model group，the treatment groupⅠ（high concentration including drug concentration 0.500 g/mL），the treatment groupⅡ（median concentration including drug concentration 0.250 g/mL），the treatment groupⅢ（low concentration including drug concentration 0.125 g/mL）and the blank group.The blank group was intraperitoneally injected normal saline.The diarrhea mice in the rest four groups were established model by intraperitoneal injection of EPECO10 bacteria liquid.The treatment groupⅠ，Ⅱ，Ⅲwere given by gavage with different concentrations of sophora flavescens extraction while the model group and the blank group with NS.The diarrhea parameters，intestinal inflammation scoring and the activities of superoxide dismutase（SOD）content.ResultsCompared the diarrhea parameters，intestinal inflammation scoring and the activities of superoxide dismutase（SOD）expression in the model group and the treatment groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ，whose difference had statistical significance（P＜0.01）.ConclusionsSophora flavescens extraction may significantly reduce the diarrhea symptom of the mice，improving the pathological changes of the intestinal tract and having a good treatment effect.

Enteropathogenic escherichia coli；Diarrhea；Animal experimentation；Superoxide dismutase；Sophora flavescens

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.05.010

:A

:1009-5519（2015）05-0665-03

2014-09-24）

安徽省高等学校省级优秀青年人才基金项目（2011SQRL046）。

吴蕊（1980-），女，安徽淮南人，硕士研究生，讲师，主要从事护理教学工作；E-mail：lemonwurui@163.com。通讯作者：余新超（（E-mail：yuxinchao1965@126.com）。