凝胶柱分离纯化茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯的工艺优化※

罗超华 李 俊

凝胶柱分离纯化茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯的工艺优化※

罗超华 李 俊

目的 探讨一种适合产业化分离纯化茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的工艺。方法 以葡聚糖凝胶为填料，研究中压柱层析分离 EGCG的效果。结果 茶多酚经脱色、过柱、冻干后得白色粉末状固体物，经高效液相色谱法（HPLC）检测EGCG的纯度达90%以上。结论 本工艺经中试验放大验证适合产业化生产。

茶多酚；表没食子儿茶素没食子酸酯；葡聚糖凝胶；柱层析；分离纯化；冷冻干燥

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是茶多酚中的一个主要生物活性成分。研究表明[1-3]，该成分具有抗肿瘤、抗白血病、抗突变、抗病毒、降血糖、降血脂等作用。因此，EGCG的提取和应用已受到广泛关注。但茶多酚组分的化学结构与性质相近、极性大、水溶性好，单体的分离难度相当大。目前，分离EGCG的方法有溶剂法、树脂法、超临界萃取法、高效液相色谱法（HPLC）等；但这些方法均存在一些问题，如超临界法得率低，树脂法所得EGCG纯度不高，溶剂法步骤繁锁，HPLC法仅用于实验室研究应用。相比之下，凝胶柱色谱具有得率高、纯度高等优势。本文以方便产业化为思路，对凝胶柱色谱分离纯化EGCG进行工艺优化进行探讨，现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 LYO-02冻干机，上海东富龙科技有限公司产品；中压色谱柱：泵EYELA VSP-3050，自动收集器EYELA DC-1200，石英玻璃柱3 cm×50 cm，均为日本东京理化产品；Water2695高效液相色谱仪，美国 Waters公司产品。

1.2 试剂 Sephadex LH-20葡聚糖凝胶，北京慧德易科技有限责任公司提供；EGCG（含量97%，批号50299-1MG-F），Sigmaaldrich公司提供，茶多酚提取物（EGCG含量40%），浙江派诺生物技术有限公司提供；甲醇（色谱纯），广州化学试剂厂生产；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 检测方法的建立 色谱柱：C18；流动相：甲醇∶水=40∶60；检测波长：278 nm；流速：1 ml/min；柱温：20 ℃。精密称取对照品 EGCG 4.0 mg于10 ml容量瓶中，流动相溶解并稀释至刻度，得每毫升含EGCG 0.4091 mg的对照品溶液，备用。精密吸取对照品储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，分别置于5 ml容量瓶中，流动相稀释至刻度，制成不同浓度的对照品溶液。依次取10 µl上述对照品溶液进样，绘制标准曲线，并计算回归方程。结果表明，EGCG在0.04091～0.40910 mg/ml呈良好的线性关系。其线性回归方程及相关系数为：Y=4523X－2657，r=0.9991。

2.2 脱色 茶叶中除了茶多酚，还含有大量的色素。目前国内一般使用氯仿或离子型树脂脱色素[4]。为寻找效果好、合适产业化的原料，比较离子型树脂、氯仿、活性炭的脱色效果，发现活性炭脱色效果与离子型树脂差不多，但从工艺角度考虑认为选用活性炭更优。

取茶多酚提取物5 g加适量水溶解，60 ℃加热搅拌下加入茶多酚 3%量的针剂型活性炭细粉，搅拌保温30 min，滤除活性炭，浓缩至1∶1待用。

2.3 洗脱溶剂的筛选 根椐文献报道[5-7]，选用丙酮-乙醇、丙酮-水、乙醇-水、甲醇-水体、丙酮-甲醇-水系进行对比研究。

取50 g凝胶溶胀后装柱，分别用上述洗脱体系平衡，加入适量经活性炭脱色的茶多酚提取物，用上述溶剂进行洗脱，10 ml自动收集后进行薄层色谱法（TLC）检识，进行单因素比较实验，见表1。

表1 洗脱剂的筛选结果

从表1可看出，丙酮-水、乙醇-水、甲醇-水体、丙酮-甲醇-水系都可以用来洗脱，但前三者必须经二次柱层析才能得到，而丙酮-甲醇-水则一次分离即得EGCG，因此选择丙酮-甲醇-水为洗脱剂。

2.4 流速与载样量的考察

2.4.1 流速的考察 取凝胶50 g，50%甲醇溶胀后装柱，再用丙酮-甲醇-水平衡。以丙酮-甲醇-水为洗脱剂，上样量1 g，考察0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 ml/min条件下的分离效果，以得率为纵坐标，流速为横坐标作图，当50 g凝胶装柱上样量在1g丙酮-甲醇-水的洗脱速度在0.0～1.5 ml/min时EGCG得率为98%以上，当流速＞1.5 ml/min时得率明显下降，故流速定于1.5 ml/min，见图1。

图1 不同流速对EGCG得率的影响

2.4.2 载样量的考察 以丙酮-甲醇-水为洗脱液，流速控制在1.5 ml/min，测试凝胶柱在不同载量下的分离效果，以得率为纵坐标，载样量为横坐标作图。分离效果随上样量的增加而逐渐变差，当上样量大于3 g/100 g（以凝胶计，下同）时，分离度下降，EGCG的得率明显降低，以生产实际出发，在纯度与得率都比较理想情况下，上样量定于4 g/100 g，见图2。

图2 不同载样量对EGCG得率的影响

2.5 干燥方式的考察 干燥方式有真空减速压干燥、喷雾干燥、红外干燥等。因本产品附加值较高，故选择冷冻干燥。针对EGCG的物性，制定冻干曲线。其冻干工艺为：①预冻干燥：药液置冰箱速冻至-30℃；②升华干燥：冻干机冷凝器降温至-40℃，抽真空至l0 Pa以下，保温2 h后升温到5℃，时间为8 h，到达5℃后保温3 h；③解析干燥：5℃后升至30 ℃，时间为3 h，30 ℃后继续保温2 h，见图3。

图3 冷冻干燥程序曲线

3 讨论

凝胶柱分离纯化茶多酚的EGCG工艺路线为：取茶多酚加水溶解，加适量的活性炭脱色后上凝胶柱进行分离，用丙酮-甲醇-水洗脱后据色带收集EGCG所在部位，得富集液后适当浓缩进行冷冻干燥，即得纯品，EGCG含量达90%以上。

在市场竞争日益激烈的当今社会，低廉的价格与优质的产品能使自己在同类产品竞争中立于不败之地，本实验秉此宗旨设计合适产业化的研究方案。茶多酚中多酚类结构极其相似，及多酚极性非常大的的物理性质，是EGCG价格居高不下的原因之一。目前，大量的相关资料[5-7]均提到应用凝胶柱色谱分离茶多酚中的EGCG，但工艺相对繁琐。本实验工艺中，茶多酚经活性炭脱色后色素基本除去，在过凝胶柱时分离度大大加强，同时应用丙酮-甲醇-水，使一次柱层析就可得到较好的EGCG纯品。本工艺经中试验放大验证，证明可行，适合产业化生产。

[1]郑红发,黄亚辉.高 EGCG茶的研究与开发[J].茶叶通讯,2007, 34(1)∶16-20.

[2]许心青,黄华涛.茶 EGCG抗癌机理研究的最新进展[J].茶叶, 2004,30(3)∶141-142.

[3]赵丽萍,邵宛芳.茶叶中 EGCG功效研究进展[J].中国农学通报,2007,23(7)∶143-147.

[4]于华忠,张东山,龚竹琼.茶叶中 EGCG含量分析研究[J].福建茶叶,2004(4)∶28-28.

[5]戚向阳,谢笔钧,胡慰望.高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的分离与制备[J].精细化工,1994,11(4)∶40-40.

[6]李兆基,吴棱,康遥,等.一种茶多酚中儿茶素类化合物的分离方法∶中国,CN 1319597A,00128567.X[P].2001.11.15.

[7]姜绍通,黄静,潘丽军,等.儿茶素单体的分离纯化方法∶中国, CN 1603319A,200410041577.3[P].2007.7.30.

Optimization of Separation and Purification for Epigallocatechin Gallate in Tea Polyphenol by Glucosan Gelatin

Luo Chaohua Li Jun

Objective To investigate the an appropriate industrialization separation and purification of EGCG from tea polyphenols.Methods Sephadex was used as filler,study the effect of EGCG medium pressure column chromatography separation.Results Tea polyphenols was processed by decolorization,column chromatography,the freezing dry white solid powder was received,the purity of EGCG is more than 90% using HPLC detection.Conclusion This process was tested in the semi-works production and was proved its suitability for industrial production.

Tea polyphenol;EGCG;Dextrane gel;Column chromatography;Separation purification;Freeze-drying

R284.2

A

1673-5846(2015)01-0017-03

南方医科大学中医药学院，广东广州 510515

广东省中医药局科研课题（课题编号：20122087、20132190）、南方医科大学科研启动计划（B1012116）

罗超华，硕士研究生，研究方向：中药有效成分药理学研究。E-mail：lchua2001@163.com

李俊，讲师，E-mail：pla_lijun@aliyun.com