黑曲霉HS-5高产β-葡聚糖酶发酵条件的优化

吴 鹏，王知龙，吴 秀

（黄冈师范学院生命科学学院，经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，湖北黄冈438000）

黑曲霉HS-5高产β-葡聚糖酶发酵条件的优化

吴 鹏，王知龙，吴 秀

（黄冈师范学院生命科学学院，经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，湖北黄冈438000）

利用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定酶活，优选黑曲霉（Aspergillus niger）HS-5发酵产β-葡聚糖酶的发酵条件。在单因素试验的基础上，采用中心组合试验原理设计响应面法优化工艺条件，得到最佳发酵条件为接种量3.11%，初始pH值为6.09，发酵时间60.02 h。在此最佳条件下，测得β-葡聚糖酶的酶活力为20.03 U/m L，比初始酶活力12.98 U/m L提高了154%。

黑曲酶；β-葡聚糖酶；工艺优化；响应面法

β-葡聚糖酶是一种能高效、专一地降解β-葡聚糖的内切酶，可使其降解为低分子质量片段[1]。它是一类存在于禾谷类的糊粉层和胚乳细胞壁中的水解酶类总称，由于β-葡聚糖的存在会导致动物对其他营养物质的消化率降低，已成为麦类饲料的抗营养因子，其酶的开发与研究已日益受到关注[2-3]。

β-葡聚糖酶用途广泛，但是由于生产提纯过程复杂、产量很小，故其应用受到限制。目前β-葡聚糖酶作为一种重要的工业酶，在饲料、食品、造纸、纺织、日化等领域发挥着重大的作用，其来源主要是用微生物发酵生产，发酵方法一般有液体发酵和固体发酵两种[4-9]。液体发酵具有原料来源广泛、价格低廉、菌体生长快速、能有效降低菌种污染率、工厂化生产、无季节性等优点，近年来越来越多地被应用到工业生产中[10-12]。本实验以黑曲霉（Aspergillus niger）HS-5菌种作为菌源，利用液体发酵法生产β-葡聚糖酶，运用单因素试验和响应面法对内β-葡聚糖酶的发酵条件进行优化，以期获得β-葡聚糖酶生产的最佳工艺条件，优化产酶发酵的工艺条件，提高酶生产效率，降低生产成本，充分发挥其潜在的应用价值，为其工业化生产奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

黑曲霉（Aspergillus niger）HS-5菌株由黄冈师范学院食品加工技术实验室提供。

1.1.2 基础发酵培养基

发酵培养基[13]：蔗糖8.0%、酵母膏2.0%、硝酸铵2.0%、醋酸钠0.1%、抗坏血酸1.0%、CaCO30.3%、K2HPO40.1%、MgSO40.05%、FeSO40.001%、pH 6.4、灭菌条件：121℃、20 m in。

1.2 仪器与设备

SP-723型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；FAl004电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；LX-B50L立式自动电热压力蒸汽灭菌器：合肥华泰医疗设备有限公司；RB-CJ-1ND超净工作台：北京瑞邦兴业科技有限公司；PHS-3C精密酸度计：上海虹益仪器仪表有限公司；SPX-150生化培养箱：中仪国科（北京）科技有限公司；THZ-82水浴振荡器：常州国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液制备

黑曲霉（Aspergillus niger）HS-5菌株活化后，再进行扩大培养，得到生长旺盛的菌种，然后再通过液体培养得到液体发酵液，取液体发酵培养好的发酵悬浮液，抽滤即得粗酶液。

1.3.2 酶活检测方法

根据曹利群[14]的3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）酶活测定法：取4 m L粗酶液，用0.2 mol/L、pH值5.5的柠檬酸缓冲液稀释50倍，取经40℃预热的此稀释液1.0 m L，加入经40℃预热的1.0%葡聚糖溶液1.0 m L，混匀，40℃下恒温反应10 m in，然后加入3.0 m L DNS停止反应，摇匀，100℃水浴5 min，冷却至室温后用去离子水定容至5.0 m L，在540 nm波长处比色，测定吸光度值A540nm。以葡萄糖含量（x）为横坐标，吸光度值A540nm（y）值为纵坐标绘制出标准曲线，获得回归方程y=2 260.2x+12.174[14]（R2= 0.999 3），计算酶活力。

β-葡聚糖酶活力单位定义为：1 m L酶液在pH值为5.5、40℃条件下，每分钟分解β-葡聚糖生成l μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活单位（U/m L）。

1.3.3 产酶单因素条件研究

不同接种量对产酶的影响：装液量均为50m L/250m L，接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%在30℃、150 r/m in进行摇瓶发酵，发酵48 h测定β-葡聚糖酶活力。

不同初始pH值对产酶的影响：装液量均为50m L/250m L，接种量2%，对其初始pH进行设计试验，调整发酵液的初始pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，其他条件均不变，发酵48 h测定β-葡聚糖酶活力。

不同发酵时间对产酶的影响：发酵30 h后，每间隔6 h测定一次酶活。基本发酵培养基的发酵时间分别调整为36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h，其他条件不变，测定β-葡聚糖酶活力。

1.3.4 响应面法优化发酵工艺条件[15]

为了更加准确确定最佳发酵条件及了解各因素之间的交互作用，在单因素试验的基础上，以接种量、培养基初始pH、发酵时间3个因素为自变量，以β-葡聚糖酶活力（Y）为响应值，对黑曲霉高产β-葡聚糖酶发酵条件进行Box-Behnken优化试验，试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Fac tors and levels of Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 不同接种量对产酶的影响

接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%对黑曲霉发酵产酶的影响如图1所示。

图1 不同接种量对产酶的影响Fig.1 Effects of different inoculum on enzyme activity

由图1可知，当接种量为3%时，发酵液酶活力最高。接种量的多少主要影响菌体的生长速度和细胞活性，接种量过大菌体生长快，但易衰老。接种量过小，则菌体生长慢，不能形成正常的菌体量以控制新陈代谢，必然会延长发酵周期。接种量＜3%时，酶活力随接种量的增大而增高，接种量＞3%时，酶活力随接种量的增大反而降低。故选择接种量为3%。

2.2 不同pH值对产酶的影响

发酵液的初始pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5对黑曲霉发酵产酶的影响如图2所示。

图2 不同pH对产酶的影响Fig.2 Effects of different pH on enzyme activity

菌株生长需要合适的pH，在一定的pH值范围内，细胞才能正常生长、繁殖和维持正常的新陈代谢，产物合成也需要适宜的pH值。由图2可知，初始pH 4.0～5.5酶活力较低，相差无几。初始pH值为6.0酶活最高，故选择发酵初始pH值为6.0。

2.3 不同发酵时间的影响

发酵时间分别为36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h对黑曲霉发酵产酶的影响如图3所示。

图3 不同发酵时间对产酶的影响Fig.3 Effects of different fermentation time on enzyme activity

由图3可知，36 h以后发酵液酶活力逐渐升高，随着时间的延长在发酵60 h时酶活力达到最高，60 h以后酶活力随着发酵时间的延长逐渐降低，故选择发酵时间为60 h。2.4响应面优化试验结果

选取接种量、初始pH值、发酵时间3个因素，以β-葡聚糖酶活力（Y）为响应值，对发酵条件进行Box-Behnken优化试验。试验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。

运用Design Expert软件对表3数据进行二次多元回归拟合，得回归方程：Y=21.16+1.44X1+1.97X2-0.24X3+2.72X1X2-1.26X1X3+2.66X2X3-8.30X12-6.88X22-10.04X32

由表3可知，回归方程中各变量对指标（响应值）影响的显著性，由F检验来判定，概率P的值越小，则相应变量的显著程度越高，相关系数R2=0.945 8，说明回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，其校正决定系数Radj=0.876 2，表明有约88.0%的酶活力变化能由该模型进行解释，说明回归模型的拟合程度很好，可以用来预测酶活。回归模型的P值＜0.000 1，模型显著。

响应面优化得到液体发酵黑曲霉最佳产酶条件为接种量3.11%，初始pH值6.09，发酵时间60.02 h，由回归方程预测酶活力为21.158 U/m L。根据回归方程，得出不同因子的响应面分析见图4。

表2 Box-behnken试验设计及结果Table 2 Design and results Box-Behnken experiments

表3 Box-Behnken试验设计方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken experiments design

图4 接种量、发酵时间和pH值对酶活交互影响的曲面图和等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of the effects of interactions of inoculum,fermentation time and pH on enzyme activity

由图4可知，接种量与初始pH值之间、接种量与发酵时间之间、初始pH值与发酵时间之间的相互作用显著。响应值（β-葡聚糖酶活力）存在最大值，各参数间的等高线呈椭圆形，相互作用显著，而且能清晰地看到最高点。

在上述响应面分析法求得的最佳条件下进行液体发酵重复试验3次，发现所测实验值为20.03 U/m L，与回归方程预测值吻合良好，模型较好地反映黑曲霉高产β-葡聚糖酶发酵条件工艺，优化模型可靠。

3 结论

本实验通过对黑曲霉HS-5发酵生产工艺进行单因素试验，再对其进行响应面的优化分析，得到发酵产β-葡聚糖酶的最佳发酵工艺条件：接种量为3.11%，初始pH值为6.09，发酵时间为60.02 h。在此最佳发酵条件下进行重复实验，测得β-葡聚糖酶的酶活力为20.03 U/m L。通过对发酵工艺条件的优化，使最终酶活力比初始酶活（12.98 U/m L）提高了154%。

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Optimization of β-glucanase fermentation conditions by Aspergillus niger HS-5

WU Peng,WANG Zhilong,WU Xiu
(Hubei Key Laboratory of Econom ic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization, Co llege of Life Sciences,Huanggang Normal University,Huanggang 438000,China)

The β-glucanase activity was determined by DNS method,and the optimal β-glucanase fermentation conditions by Aspergillus niger HS-5 was optimized.On the basis of single factor experiment,the technology conditions were optimized by central composite design and response surface methodology.The results showed that the optimal conditions were inoculum 3.11%,fermentation medium initial pH 6.09,and culture time 60.02 h. Under the optimal fermentation conditions,the β-glucanase activity was up to 20.03 U/m l,which was increased by 154%comparing to the initial activity of 12.98 U/m l.

A spergillus niger;β-glucanase;optimization;response surface methodology

TQ925

A

0254-5071（2015）03-0054-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.012

2015-02-26

湖北省自然科学基金项目（2013CFB472）

吴鹏（1982-），女，讲师，博士，研究方向食品生物技术和农产品加工与贮藏。