粉防己碱对白念珠菌生物膜及芽管形成的影响

郭兰芳 刘大标 周梦婕 华腾江（镇江市第四人民医院检验科，镇江212001）



粉防己碱对白念珠菌生物膜及芽管形成的影响

郭兰芳 刘大标 周梦婕 华腾江
（镇江市第四人民医院检验科，镇江212001）

【摘要】目的 研究粉防己碱（Tet）对白念珠菌（Candida albicans）生物膜及芽管形成的影响。方法 采用XTT还原比色法观察Tet对C．albicans成膜的影响；将0．01、0．1、1 μmol／L的Tet分别与C．albicans悬液共同孵育，显微镜下计数芽管形成率。分别设阳性对照组（两性霉素B与白念珠菌悬液共孵育）和阴性对照组（白念珠菌悬液中不加Tet），试验重复5次。结果 Tet各剂量组对C．albicans生物膜及芽管形成具有明显抑制作用（P＜0．05），其作用与药物浓度呈正相关，其中1 μmol／L的Tet对C．albicans生物膜及芽管形成的抑制率最高，C．albicans生物膜及芽管形成率低于阴性对照组（P＜0．05），1 μmol／L的Tet组生物膜及芽管形成率低于0．01及0．1 μmol／L组（P＜0．05）。与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。结论 Tet对体外C．albicans生物膜及芽管形成有一定的抑制作用。

【关键词】粉防己碱；白念珠菌；芽管；生物膜

[Chin J Mycol，2015，10（5）：276⁃278]

近年来，随着广谱抗生素及免疫抑制剂的广泛应用，耐药菌株逐年上升，真菌感染呈明显上升趋势，并伴随并发症的发生。念珠菌属于病原真菌，尤其是白念珠菌（Candida albicans）可引起体表感染乃至严重的全身系统性疾病，是医院感染最主要的病原菌[1]。生物膜态白念珠菌在临床感染的过程中扮演着重要的角色[2]。传统中药具有作用持久，毒性小等特点，因此从中药中寻找抗白念珠菌生物膜的新药无疑是一个新的选择。我们以往的研究表明适当浓度的粉防己碱（Tet）可以协同β⁃葡聚糖刺激巨噬细胞的免疫作用[3]，但其对白念珠菌生物膜及芽管形成是否有抑制作用并未见报道。本研究拟观察Tet对白念珠菌生物膜及芽管形成的抑制作用，为其在治疗白念珠菌感染中提供新思路。

1　 材料与方法

1．1 材料

菌株 白念珠菌（ATCC90028），购自中国医学科学院微生物研究所。

试剂 Tet（浙江金华制药厂）；RPMl 1640 （Gibco公司）；YPD培养基、XTT试剂盒（Sigma公司）。

仪器设备 96孔微量细胞培养板（美国Cor⁃ning公司）；恒温摇床（武汉科学仪器厂）；恒温培养箱（上海跃进医疗器械一厂）；550型酶标仪（BIO⁃RAD，美国）；相差显微镜（Olympus）。

1．2 方法

制备菌液 将C．albicans划线接种培养后，挑选4个菌落接种于YPD培养基，35℃摇床培养过夜，离心收集真菌，用RPMI 1640调整真菌浓度为1×109／mL。

Tet抑制白念珠菌芽管生成试验 将上述浓度的细菌悬液分为5组，分别为Tet终浓度0．01、0．1、1 μmol／L组以及阴性、阳性对照组；阳性对照组加入两性霉素B，阴性对照组加入无菌PBS液。37℃孵育3 h后取样，高倍镜下计数芽管生成数。芽管生成率＝（带芽管菌数／白念珠菌总数）×100%[4]。

XTT减低试验 分别测定0．01、0．1、1 μmol／L剂量组Tet对白念珠菌生物膜内真菌的杀灭作用，设立对照组（Tet为0 μmol／L）。微孔板法培养白念珠菌生物膜48 h。每组设置5个孔，各重复3次。每次用PBS冲洗3次，洗去浮游菌。每孔加入100 μL用RPMI 1640预配置好的不同浓度的Tet，放置在恒温培养箱中作用5 h。再用PBS冲洗3次，洗去多余的药液。然后向每个标本中加入RPMI 1640液体培养液100 μL和XTT工作液50 μL，37℃避光作用5 h，弃去多余的试剂。酶标仪测定光密度（OD450）值。

1．3 统计学处理

应用SPSS 16．0统计软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（ୱx±s）表示，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2　 结 果

2．1 Tet对白念珠菌芽管形成的影响

在本试验中，Tet各剂量组（0．01、0．1、1 μmol／L）的芽管形成率均低于阴性对照组（P＜0．05）；1 μmol／L剂量组与阳性对照组芽管生成率差异无统计学意义（P＞0．05）；0．01、0．1 μmol／L剂量组的芽管生成率高于阳性对照组（P＜0．05）；1 μmol／L剂量组与0．01、0．1 μmol／L剂量组之间差异有统计学意义（P＜0．05）；0．01与0．1 μmol／L剂量组之间差异无统计学意义（P＞0．05）。见表1。

2．2 XTT减低试验

Tet各剂量组（0．01、0．1、1 μmol／L）干预C．al⁃bicans生物膜后的OD450值与对照组比较均有一定程度的减少。其中0．1、1 μmol／L剂量组与对照组比较对C．albicans生物膜有明显抑制作用（P＜0．05）；0．01 μmol／L剂量组与对照组比较，对生物膜没有显著的抑制作用（P＞0．05）。见表2。

表1　Tet对白念珠菌芽管生成率的影响（ୱx±s，n＝5）Tab．1 Effect of Tet on C．albicans germ tube formation rate（ୱx±s，n＝5）

表2　Tet对白念珠菌生物膜的作用（xୱ±s，n＝5）Tab．2 Effect of Tet on C．albicans biofilm（ୱx±s，n＝5）

3　 讨 论

粉防己碱（tetrandrine，Tet）是从中药粉防己中提取的一种双苄基异喹生物碱化合物，临床常用于治疗各种高血压、风湿性疼痛、关节炎和肌肉痛等疾病。有研究表明，Tet对氟康唑抗白念珠菌等深部真菌有良好的增效作用[5]。白念珠菌能形成生物膜，生物膜由不同形态的菌体共同构成，包括酵母相、假菌丝相和菌丝相细胞[6⁃7]。据报道体内外生物膜模型内真菌的耐药性比浮游菌增加了近1 000倍[8]，生物膜的感染越来越成为临床上难以克服的问题之一。目前临床应用的抗真菌药物在高效低毒、抗菌谱和耐药性方面不能令人满意，因此，从中草药中寻找抗真菌新药用于临床或与唑类药物联合应用，弥补唑类药物治疗中的不足，已成为非常重要的研究方向[9]。本研究用XTT减低试验定量分析Tet对白念珠菌生物膜内真菌的抑制作用。XTT是线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色四氮盐⁃甲替[10]，当XTT与电子耦合剂联合应用时，其所产生的水溶性的四氮盐⁃甲替的光密度与活细胞的数量成正比。本研究结果显示，随着Tet浓度的增加，OD450值与对照组相比有逐渐下降的趋势，间接说明白念珠菌生物膜内菌体的活力逐渐下降，Tet通过增加渗透到生物膜内的浓度进而杀灭生物膜内的菌体，阻止生物膜的进一步发展。该研究结果提示在一定浓度范围内，Tet对白念珠菌生物膜内真菌的杀灭作用呈浓度依赖性，Tet浓度增高，其对生物膜内真菌的杀灭作用越强。白念珠菌由酵母相转变为菌丝相过程中形成芽管是其转变为致病菌的标志。有研究表明[11]白念珠菌芽管形成后明显增加了细胞表面的疏水性，Li等[12]认为白念珠菌生物膜的形成能力与细胞表面疏水性呈正相关。由此推测白念珠菌芽管形成可促进其生物膜的形成。我们研究结果表明0．01、0．1、1 μmol／L的Tet均能有效降低白念珠菌芽管形成率，随着Tet作用剂量的增加，其抑制白念珠菌芽管形成的效应也随之增强。提示一定浓度的Tet能通过抑制白念珠菌的芽管形成进而抑制其生物膜的形成及致病性。

综上，我们的研究结果初步表明应用Tet治疗真菌生物膜感染具有一定的潜力，可为临床开发抑制白念珠菌生物膜的中药制剂提供一定的参考，未来的研究还需进一步探究其药理作用及抑菌机制。

参考文献

[1] Douglas LJ．Candida biofilms and their role in infection[J]．Trends Microbiol，2003，11（1）：30⁃36．

[2] Ramage G，Martinez J R，LÓpez⁃ribot J L．Candida biofilms on implanted biomaterials：a clinically significant problem[J]．FEMS Yeast Res，2006，7（6）：979⁃986．

[3] 郭兰芳，刘大标，倪慧艳，等．粉防己碱对β⁃葡聚糖诱导的巨噬细胞生长、胞内游离钙及cAMP表达的影响[J]．现代检验医学杂志，2014，29（03）：81⁃83．

[4] 苑天红，王明永，吴升伟，等．白念珠菌二相性与致病性的关系[J]．中国公共卫生，2005（1）：71⁃72．

[5] 高爱莉，张宏，莫宏波，等．汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌增效活性的分子机制探讨[J]．中华皮肤科杂志，2008，41 （2）：97⁃100．

[6] Kumamoto CA．Candida biofilms[J]．Curr Opin Microbiol，2002，5（6）：608⁃611．

[7] Borecká⁃Melkusová S，Moran GP，Sullivan DJ，et al．The expres⁃sion of genes involved in the ergosterol biosynthesis pathway in Candida albicans and Candida dubliniensis biofilms exposed to fluconazole[J]．Mycoses，2009，52（2）：118⁃128．

[8] Shaw G，Price A M，Ktori E，et al．Hedgehog signaling in andro⁃gen Independent prostate cancer[J]．Eur Urol，2008，54（6）：1333⁃1343．

[9] 方建茹，龙凯，谢小梅．中药抗真菌的研究进展[J]．上海中医药杂志，2005，39（3）：60⁃62．

[10] 胡望平，冯福英，叶桂云，等．血清c⁃PSA及C／T在提高前列腺癌诊断特异性中的探讨[J]．第三军医大学学报，2007，29 （18）：1815⁃1817．

[11] Rodrigues AG，Mardh PA，Pina⁃Vaz C，et al．Germ tube forma⁃tion changes surface hydrophobicity of Candida cells[J]．Infect Dis Obstet Gynecol，l999，7（5）：222⁃226．

[12] Li X，Yan Z，Xu J．Quantitative variation of Biofilms among strains in natural populations of Candida albicans[J]．Microbiol⁃ogy，2003，149（2）：353⁃362．

[本文编辑] 王 飞

（上接第265页）The effects of tetrandrine on Candida albicans biofilm and germ tube formationGUO Lan⁃fang，LIU Da⁃biao，ZHOU Meng⁃jie，HUA Teng⁃jiang

（Department of clinical laboratory，Fourth People＇s Hospital of Zhenjiang，Zhenjiang 212001）

【Abstract】Objective To study the effects of tetrandrine（Tet）on Candida albicans biofilm and germ tube formation．Methods Using the XTT method to observe the effect of Tet on C．albicans biofilm．0．01，0．1，1 μmol／L of Tet and C．albicans suspensions were incubated together，then the rates of bud tube were counted．The experiment was repeated 5 times．Results Tet had obvious inhibitory effects on C．albicans biofilm and the germ tube（P＜0．05）．The biofilm and germ tube formation inhibition rate was the highest in 1 μmol／L of Tet，compared with the negative control group（P＜0．05）and the 0．01，0．1 μmol／L groups（P＜0．05）．Conclusions Tet had inhibitory effect on C．albicans biofilm and germ tube formation．

【Key words】tetrandrine；Candida albicans；germ tube；biofilm

[收稿日期]2015⁃04⁃14

基金项目：镇江市科技计划项目（SH2013062）

【文章编号】1673⁃3827（2015）10⁃0276⁃03

【文献标识码】A

【中图分类号】R 379．5

作者简介：郭兰芳，女（汉族），硕士，主管技师．E⁃mail：guolan⁃fang415＠163．com