抗真菌肽MAF-1A体外对近平滑念珠菌生物膜形成能力的影响、与生物膜结合及抑菌情况观察

成荣，李红凌，胡方芳，许强,3，罗振华,3，李伟

1贵州大学医学院，贵阳 550025；2 贵州省人民医院；3 国家卫生健康委员会肺脏免疫性疾病诊治重点实验室；4 贵州医科大学附属医院

近平滑念珠菌是一种机会性真菌感染病原体，是第二或第三临床常见的真菌感染病原体[1]。近平滑念珠菌的致病性与多个毒力因子的影响密切相关，如黏附于人体组织、器官和植入性的医疗器械，分泌各种裂解酶(蛋白酶，磷脂酶和溶血素)，可表型转换，形成生物膜及逃避免疫系统攻击等[2,3]，其中生物膜的形成被认为是近平滑念珠菌一个重要的毒力因子。生物膜是由菌体在其分泌的细胞外基质内包裹中形成的致密结构，与病原体的耐药性形成密切相关，生物膜相关感染性疾病的治疗难度增大[4,5]。发达国家多种医院感染性疾病的发生与生物膜形成有关，如心内膜炎、骨髓炎、鼻窦炎、尿路感染、慢性前列腺炎、牙周炎等[6,7]。因此，为有效防治与生物膜形成相关的感染性疾病，研发新的药物具有重要意义。抗菌肽具有抑制生物膜形、破坏生物膜结构及杀死生物膜内细胞的能力。抗菌肽hLF 1-11是人源N-端乳铁蛋白衍生肽，Roberta等[8]研究发现，hLF1 -11可通过显著降低生物膜细胞密度和代谢活性，下调生物膜形成相关基因CpALS7、 CpACE2、 CpEFG1等的表达，抑制近平滑念珠菌生物膜的形成。MAF-1(Musca domestica antifungal peptide -1)是经免疫诱导后从家蝇(Musca domestica)幼虫血淋巴中分离得到的一个新型抗真菌肽[9]。MAF-1A是MAF-1碳端α螺旋功能结构域第128-153位26个氨基酸肽段[10]。我们前期研究[11]发现，MAF-1A对多种常见致病性念珠菌均表现出一定的抗菌活性。本研究通过体外培养形成近平滑念珠菌生物膜，观察不同浓度MAF-1A对近平滑念珠菌生物膜形成及对生物膜细胞活性强弱的影响，了解MAF-1A对近平滑念珠菌的抗菌作用特点，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株、试剂及仪器 近平滑念珠菌标准株ATCC22019，近平滑念珠菌临床株F1356、F983、F668由贵州省人民医院中心实验室于-80 ℃保存。抗真菌肽MAF-1A及其荧光标记衍生肽FITC-MAF-1A均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，使用分析型高效液相色谱(HPLC)鉴定其纯度>95%，行ESI质谱检测，确认多肽序列正确。主要试剂：沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)，沙氏葡萄糖液体培养基(SDB)购于北京索莱宝科技有限公司，氟康唑(FLC)购于美国Sigma公司，细胞活性检测试剂盒XTT Assay Kit (ab232856) 购于英国Abcam公司。

1.2 MAF-1A的体外抗真菌活性观察

1.2.1 不同稀释浓度SDB培养基的选择 将经SDA平板活化的ATCC22019菌体适量重悬于SDB、1/2SDB、1/4SDB、1/8SDB、1/16SDB、1/32SDB培养基中，每孔200 μL加入无菌96孔板中35 ℃恒温培养24 h后检测OD490nm值。SDB、1/2SDB、1/4SDB、1/8SDB、1/16SDB、1/32SDB培养基中ATCC22019的OD490nm分别为0.160±0.005、0.162±0.008、0.161±0.006、0.119±0.002、0.052±0.003、0.045±0.001，SDB、1/2SDB、1/4SDB培养基中ATCC22019的OD490nm组间相比差异无统计学意义，说明SDB、1/2SDB、1/4SDB浓度培养基未影响ATCC22019生长。

1.2.2 MAF-1A最低抑菌浓度(MIC)测定 参考临床和实验室标准研究所(CLSI)M27-A3测定MAF-1A的抗真菌活性。取活化的ATCC22019菌落重悬于SDB、1/2SDB、1/4SDB培养基中，浓度调至1～5×103CFU/mL。加入不同浓度MAF-1A(0.1、0.2、0.3 、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及1.0 mg/mL)，无MAF-1A处理的菌悬液为生长对照，培养基为空白对照孔，另选择0.1 mg/mL的FLC为药物对照。经35 ℃恒温培养24 h，测定吸光度OD490nm值，最低抑菌浓度(MIC)值[12]：真菌生长百分率=(各孔OD490nm值-空白对照孔OD490nm 值)/(生长对照孔OD490nm值-空白对照孔OD490nm值)×100%；真菌生长抑制百分数=(1-真菌生长百分数)×100%。取真菌生长抑制百分数≥80%的最低药物浓度为MIC值。结果发现，1/4SDB培养基中MAF-1A能更好的发挥抗ATCC22019菌活性，其MIC值为0.3 mg/mL。

1.3 不同浓度MAF-1A对近平滑念珠菌生物膜形成的影响观察

1.3.1 生物膜形成菌株选择 取-80 ℃保存的F668、F983、F1356、ATCC22019接种于SDA平板上，35 ℃恒温培养24 h复苏菌株，挑取直径>5 mm的单菌落于1/4SDB中混匀为菌悬液，调整浓度2×106CFU/mL，100 μL/孔加入到取聚苯乙烯无菌96孔板中,37 ℃培养24 h，无菌PBS缓冲液(PH=7.2～7.4)清洗3遍将未附着的菌体洗下并检测OD490nm值。实验设置3个生物学重复。根据如下判定方法判定菌株生物膜形成能力[13]：OD490nm<0.03，无生物膜形成能力；0.03≤OD490nm<0.08，生物膜形成能力弱；0.08≤OD490nm<0.16生物膜形成能力一般；OD490nm>0.16，生物膜形成能力强[13]。F668、F983、F1356、ATCC2201的OD490nm分别为0.002±0、0.032±0.02、0.133±0.007、0.004±0.004，F1356具有体外生物膜形成能力，F668、F983、ATCC2201均无体外生物膜形成能力。镜下可见体外培养时，F1356形成的生物膜菌体密度高且连接紧密，形成较致密的结构。因此本研究后续以该菌所形成的生物膜进行有关近平滑念珠菌生物膜相关的实验研究。

1.3.2 不同浓度MAF-1A处理的F1356生物膜形成能力检测 取F1356菌体适量于1/4SDB中，调整菌液浓度为2×106CFU/mL，100 μL/孔加入到无菌聚苯乙烯96孔板中，37 ℃恒温培养24 h，PBS清洗3遍，将F1356分为5份，每份3个复孔，其中四份分别加入100 μL浓度为0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的 MAF-1A 使其，加入无菌水者为空白对照。另将F1356分为5份，每份3个复孔，其中4份分别加入0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的FLC，加入无菌水者为空白对照。37 ℃培养24 h，PBS清洗3遍，Synergy H1微孔板检测仪检测OD490nm值，以OD490nm值代表MAF-1A、FLC处理的F1356生物膜形成能力。重复3次，取平均值。并于倒置显微镜下观察F1356生物膜中的菌体密度及膜致密结构。

1.3.3 MAF-1A与F1356生物膜结合情况观察 采用荧光标记技术。体外培养F1356使其形成生物膜，培养方法同“1.3.1”。在培养液中加入0.6 mg/mL的 FITC-MAF-1A培养，分别于培养1、3、6、12、24 h时取共培养液，PBS洗涤3次，荧光显微镜下(蓝光激发)观察MAF-1A与F1356生物膜的结合情况。荧光标记的衍生肽FITC-MAF-1A可与F1356生物膜结合并进入生物膜内，镜下可观察到黄绿色荧光信号。

1.3.3 不同浓度 MAF-1A处理的F1356生物膜细胞活性强弱检测 采用XTT细胞活性检测技术。将F1356菌体分为5份，每份3个复孔，其中4份分别加入100 μL浓度为0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的 MAF-1A 使其，加入无菌水者为空白对照。37 ℃培养24 h，PBS清洗3遍，按照XTT Assay Kit (ab232856) 试剂盒操作说明检测F1356生物膜内细胞活性。Synergy H1微孔板检测仪检测OD450nm值，以OD450nm代表F1356生物膜的细胞活性。实验中全程闭光操作。重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 不同浓度MAF-1A处理的F1356生物膜形成能力比较 0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL MAF-1A处理的F1356生物膜形成能力分别为0.156±0.011、0.071±0.007、0.025±0.003、0.007±0.002，空白对照孔为0.163±0.009，与空白对照比较，0.6、0.9、1.2 mg/mL的 MAF-1A处理的F1356生物膜形成能力降低(P≤0.05)。0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL FLC处理的F1356生物膜形成能力分别为0.144±0.008、0.073±0.007、0.023±0.005、0.004±0.002，空白对照孔为0.144±0.008，与空白对照比较，0.6、0.9、1.2 mg/mL的 FLC处理后F1356生物膜形成能力降低(P≤0.05)。

镜下可见与对照组相比，0.6、0.9、1.2 mg/mL的MAF-1A处理的F1356生物膜中菌体密度减少，膜致密结构被破坏；与对照组相比，0.6、0.9、1.2 mg/mL的FLC处理的F1356生物膜中菌体密度减少，膜致密结构被破坏。见图1。

注：A, F为空白对照；B为0.3 mg/mL MAF-1A 处理的F1356；C为0.6 mg/mL MAF-1A 处理的F1356；D为0.9 mg/mL MAF-1A处理的F1356；E为1.2 mg/mL MAF-1A 处理的F1356；G为0.3 mg/mL FLC 处理的F1356；H为0.6 mg/mL FLC 处理的F1356；I为 0.9 mg/mL FLC 处理的F1356；J为 1.2 mg/mL FLC 处理的F1356。

2.2 MAF-1A与F1356生物膜的结合情况 随培养时间延长，镜下可见黄绿色荧光信号逐渐增多，培养24 h时可观察到生物膜内存在大量黄绿色荧光信号。见图2。

图2 培养1、3、6、12、24 h MAF-1A与近平滑念珠生物膜的结合情况

2.3 不同浓度MAF-1A处理的F1356生物膜细胞活性比较 0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL MAF-1A处理的F1356生物膜活性分别为0.873±0.031、0.655±0.029、0.535±0.038、0.471±0.017，空白对照孔为1.268±0.167，随MAF-1A浓度增加，F1356生物膜细胞活性逐渐降低(P均≤0.05)。0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL FLC处理的F1356生物膜活性分别为0.841±0.061、0.845±0.050、0.894±0.036、0.982±0.056，空白对照孔为1.368±0.144，与对照组比较，0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL FLC处理的F1356生物膜活性降低(P均≤0.05)，与0.3 mg/mL FLC比较，0.9、1.2 mg/mL FLC处理的F1356生物膜活性升高(P均≤0.05)。

3 讨论

近平滑念珠菌的感染率增加与其易黏附于固体材料表面及易在导管等医用材料上形成生物膜密切相关[14]，生物膜形成后对常用抗真菌药物敏感性大大降低[15]。我们发现，MAF-1A在0.6 mg/mL浓度下即可抑制近平滑念珠菌生物膜的形成。随药物剂量及作用时间的增加，MAF-1A抑制近平滑念珠菌生物膜形成作用增强，提示MAF-1A对生物膜形成具有较好的抑制作用，其作为抗生物膜药物开发资源具有重要研究价值。

目前生物膜的耐药性机制尚不明确。有研究[16]报道，近平滑念珠菌生物膜内菌体生长结构发生变化，菌丝相的菌体所占比例增加，同时，生物膜内细胞代谢较游离状态的细胞增加，这些变化可能有利于其对抗真菌药物产生耐受。关于生物膜的耐药机制研究中，抗菌药物的渗透障碍被认为是生物膜耐药性产生的主要原因之一[17]。研究[18,19]发现，抗菌药物不能有效的结合并进入膜内，从而使抗菌药物作用效果减弱。相较于游离状态的菌体，生物膜菌体连接紧密，密度高，尤其是生物膜形成的特殊细胞外基质，主要成分为水不溶性的胞外多糖，极大阻碍了抗菌药物进入生物膜发挥抗菌效应。我们通过固相合成抗真菌肽MAF-1A的荧光标记衍生肽(FITC-MAF-1A)，并将FITC-MAF-1A与F1356生物膜共同孵育不同时间后在荧光显微镜下观察发现，随着作用时间的延长，越来越多的MAF-1A结合于F1356生物膜，并在膜内聚集，这提示我们，MAF-1A与F1356生物膜具有较好亲和性，能透过生物膜进入膜内。我们推测，这可能与抗菌肽本质为蛋白质，与生物膜的亲和性较其他类型的药物要高，这是其可应用于抗生物膜药物研发资源的一大优势。有研究报道，生物膜细胞活性增加，代谢活性增强，使得生物膜对抗菌药物的适应性，代谢等能力增强。这可能是导致生物膜耐药性较高的原因之一。在我们的研究中，MAF-1A作用下F1356生物膜细胞活性降低，随着多肽浓度的增加细胞活性逐渐降低。结合荧光显微镜观察结果，MAF-1A可结合并逐渐聚集于生物膜细胞内，推测随着作用时间延长，进入生物膜细胞内MAF-1A通过破坏细胞膜、胞内细胞器等结构，紊乱细胞正常的代谢反应，从而影响细胞活力。MAF-1A具有较好的抗生物膜特性，可作为抗生物膜药物研发对象。

综上所述，MAF-1A可抑制F1356的生物膜形成，且MAF-1A可与F1356生物膜结合进入生物膜内，抑制F1356生物膜的细胞活性，可作为抗生物膜药物研发对象，值得我们进行更为深入的研究。