乳酸菌生物膜的形成及其影响因素

王星，张华，2，张淼，王小杰，谈重芳

（1.郑州大学物理学院（微电子学院）河南省离子束生物工程重点实验室，郑州450052；2.河南牧业经济学院食品生物工程学院，郑州450046）

0 引 言

乳酸菌是指能够通过发酵碳水化合物即糖类产生乳酸的无芽孢、不运动或少运动、革兰氏呈阳性、过氧化氢呈阴性的一类细菌的总称[1]，具有耐酸耐胆盐、抑制致病微生物、抗氧化活性[2]、调节肠道微生物群[3]，提高人体免疫力[4]等多种功效，并且能够帮助预防、治疗或辅助治疗多种疾病的发生。

生物膜是一种有组织的、具有功能性的细菌群体，是由菌体外的大量胞外基质与细菌团块组成的微生物集合体[5]。自然界中的微生物在一定适当情况下几乎都能形成生物膜，当细菌形成生物膜时，对抗生素或宿主本身免疫防御系统的抵抗作用将会增强[6]，所以目前对生物膜的研究大多集中在细菌生物膜的耐药性及生物膜的清除方法[7]上面。

对于乳酸菌是益生菌这一说法，人们早已了解并对其进行了广泛利用，但目前人们对乳酸菌等益生菌生物膜作用机制的研究还很有限。生物膜具有黏附性，耐药性，移动性等特点[8]，如果病原菌形成生物膜，便会给临床治疗带来很大困难[9]，但如果益生菌形成生物膜，则能更好的黏附到人体，更好地发挥益生作用。生物膜形成可以使乳酸菌菌体结构更加稳定，显著提高自身抗逆性[10]，可以帮助乳酸菌抵御外界的不利因素等[11]。但生物膜的形成和发展受多种因素的影响，本文主要对乳酸菌生物膜的形成以及影响乳酸菌生物膜形成的因素进行了阐述。

1 乳酸菌生物膜的形成及其影响

1.1 组成

生物膜的结构及成分极其复杂，其形成和发展受到多重因素影响，成熟的生物膜主要包括细菌分泌的胞外聚合物和细菌生命体等[12]。胞外聚合物主要是指细菌分泌的各种生物大分子物质如多糖，蛋白质等，这些物质能够加强微生物细胞对外界的抵抗能力，同时还对细胞膜的稳定性[13]有一定影响。

1.2 形成机制

乳酸菌生物膜的形成与细菌生物膜的形成一样，都是动态发展的过程，主要包括以下5个阶段[11]。

（1）生物膜的可逆黏附：细菌成熟生物膜形成的首要要求就是要先与物体进行接触，首先菌体黏附到物体的表面，物体表面准备形成生物膜，在这一阶段，细胞的黏附强烈依赖于细菌细胞表面的物理化学性质。

（2）生物膜的不可逆转黏附期：当进行黏附的细菌不断增多，使一些特定基因得到表达，由此生物膜开始形成，与此同时，大量的多聚物被分泌到胞外，细菌的黏附由细菌与表面的弱相互作用转变为与胞外多糖的永久性结合[14]。

（3）生物膜结构的早期发展：在细菌与物体的黏附变为不可逆后，细胞大量聚集形成微生物菌群，这是微生物积累和生物长的共同结果，是产生胞外多糖的主要阶段[15]。这些胞外多糖可以使微菌落的结构变得更加稳固，从而使得生物膜变厚。

（4）生物膜的成熟：进入成熟期的生物膜会形成有组织的结构，此结构的形成是由于类似蘑菇状或株状的细菌团块不断累加堆积导致的,从而使得生物膜变得更加厚,并开始围绕着菌落旁的输水管道进行着养料、酶、代谢产物的运送传输以及废物的排出。

（5）生物膜的分散：分散是指将生物膜或载体表面的细菌解离释放出来。生物膜结构成熟后，生物膜细胞将从物体表面脱离，并且立刻恢复为浮游生物，开始寻找新的结合位点，在物体的表面进行新一轮生物膜的形成。

1.3 乳酸菌生物膜的影响

1.3.1 乳酸菌生物膜对其耐受性的影响

乳酸菌生物膜在形成过程中，涉及到多种基因的表达及电荷转移等物理化学变化，经历各种外界环境压力，导致其相关应激基因表达量提高，且对环境适应及耐受能力也得到提高[10]。张国丽等人[16]的研究表明，植物乳杆菌SCP53 生物膜成熟后对温度、酸碱度、盐度的耐受力都得到显著提升。王坤等人[17]的研究表明了类似的结果，乳酸菌混菌生物膜与游离菌株相比对酸和高温具有更高的抗性，且能够稳定释放游离菌株。Hiromi Kubota 等人[18]对成膜后的植物乳杆菌的研究表明，与浮游细胞相比，成膜后的菌株对机酸、乙醇或次氯酸钠具有更高的抗逆性。这些结果表明，生物膜的形成使乳酸菌具有更高的耐受性。

1.3.2 乳酸菌生物膜对其抑菌能力的影响

乳酸菌附着于肠道表面形成一定的生物膜，与其他物质竞争营养物质和空间，从而抑制有害菌的黏附并分泌过氧化氢，有机酸等物质来抑制病原菌的生长[19]。Barbarb 等[20]研究者发现，在乳酪生产中四种乳酸菌（植物乳杆菌DSM1055，干酪乳杆菌DSM20011，弯曲乳杆菌DSM20019，副干酪乳杆菌DSM20207）混菌生物膜可以有效地抑制李斯特菌的生长。Elena等[21]的研究表明乳酸菌黏附于口腔黏膜及成为牙齿生物膜一员竞争牙齿病原菌，来抑制病原菌的生长。

1.3.3 乳酸菌生物膜对发酵工业的影响

乳酸菌形成生物膜后具有稳定的结构，在工业化发酵工程中具有良好的潜能。Rangaswamy 等[22]人利用德氏乳杆菌形成的生物膜填充到反应器中来生产乳酸，极大地提高了乳酸的生产效率。Furukawa 等[23]的研究表明，酿酒酵母与植物乳杆菌混合生物膜的形成促进米醋发酵。除此之外，酿酒酵母与植物乳杆菌混合生物膜可作为一个稳定高效生产酒精的手段，不需要人工操作即可通过不到20%的葡萄糖便能产生足够的乙醇[24]。

2 影响乳酸菌生物膜形成的因素

2.1 葡萄糖对乳酸菌生物膜形成能力的影响

葡萄糖作为乳酸菌生长的重要能量来源以及生物膜的组成部分，为其提供生长所必须的营养，因此影响着乳酸菌的生长及其生物膜的形成。张立东等[25]研究了四株乳酸菌生物膜形成的影响因素，表明在无葡萄糖的MRS 培养基上乳酸菌的生长受到显著抑制，且几乎无法形成生物膜。因此，组成生物膜的胞外多糖是由菌体自身分泌的，葡萄糖的有无影响着乳酸菌的生长，从而影响乳酸菌生物膜的形成能力。任晓镤等[26]对戊糖乳杆菌生物膜的研究也得出类似的结果，虽然乳酸菌的生长能力随着葡萄糖浓度的增加会加强，但其成膜能力则先增强后下降，由此说明了适于乳酸菌形成生物膜的葡萄糖浓度有一定范围，浓度过高或过低都会产生不利的影响。

2.2 金属离子对乳酸菌生物膜形成能力的影响

金属离子如Cu2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Na+等与生物膜的形成关系密切。在任晓镤等[26]对戊糖乳杆菌生物膜的研究中显示出一定浓度的Ca2+对可以影响其生物膜的形成，当Ca2+质量分数为1.5%时，对戊糖乳杆菌生长情况的影响并不大，但其生物膜的形成能力在Ca2+质量分数到达0.5%时就基本被完全抑制。王尧禹等[27]的研究显示出类似的结果，其研究表明氢氧化钙能够通过抑制粪肠球菌毒力因子等的表达来抑制其生物膜的形成。Lukas Gritsch 等[28]研究表明Cu2+和Cu+对生物膜的形成能力都有一定的抑制作用，其中Cu+对生物膜具有更强的抑制作用。张国丽等[29]研究表明，Cu2+通过抑制生物膜分泌胞外多糖达到破坏生物膜稳定性，抑制生物膜形成的目的。

Mn2+对乳酸菌生物膜的形成具有促进作用，在Yanjun Yong 等人[30]的研究中，Mn2+的存在能够促进植物乳杆菌CCFM436 分泌胞外蛋白，增加乳酸菌生物膜的稳定性。Soma Nozaka 等[31]人对植物乳杆菌及混合菌生物膜形成能力的研究中，同样表明了锰离子的添加能够促进植物乳杆菌单菌及混合菌形成致密的生物膜。Mg2+是多种酶的辅基，林雅茵等[32]认为Mg2+能够使细菌的早期黏附能力得到加强，还能影响生物膜初期和成熟期的结构，因此Mg2+的添加会使得生物膜变得更为复杂。

多数的乳酸菌分离株都能耐4.0%和6.5%的NaCl[33]，其在质量分数为18%和6.5%的氯化钠中的生长情况是鉴别其有关属的一项重要指标[34]，因此NaCl浓度的大小也影响着乳酸菌生物膜的形成。在徐文生等[35]就NaCl 对长双歧杆菌生物膜形成能力的影响研究中，表明一定浓度的Na+对形成生物膜有促进作用，该结果与任晓镤等[36]对植物乳杆菌生物膜的研究结果一致。Knobloch 等[37]指出NaCl 能够抑制用于阻止生物膜形成的icaR 基因的表达，还能激活用于诱导生物膜的形成SigB 和RsbU 因子，从而促进形成生物膜。

2.3 pH 对乳酸菌生物膜形成能力的影响

pH 值在微生物生物膜形成过程中有着非常大作用，有研究称，pH 对生物膜的影响主要是通过影响电子转移而产生的[38]，因而适合生物膜形成的pH 范围极窄。对于乳酸菌来说，乳酸菌本身能够产生乳酸，因此在pH 值偏酸性条件下，乳酸菌能够生长并形成膜。任晓镤等[26]、张国丽等[29]通过对乳杆菌进行研究，表明乳杆菌生物膜形成能力最强时的pH 值为5.5～6.8，在pH 值小于3.8 或大于6.8 时其生长及生物膜形成能力会受到明显的抑制。在Lebeer S 等[39]对鼠李糖乳杆菌的研究中提及，pH 能够通过影响鼠李糖乳杆菌的细胞表面，从而影响生物膜的发育，其研究结果显示，鼠李糖乳杆菌在初始pH 为4.0 时其生物膜的形成会受到抑制。这些都说明了每种微生物都有最适合自身生长的pH 值，pH 值过高或过低都会产生不利影响，会导致微生物生长速率过慢，菌体产生数量过低，从而不易于膜的形成[33-37]。

2.4 不同食品添加剂对乳酸菌生物膜形成能力的影响

乳酸菌是食品中常见的益生菌，影响发酵食品的生成，而食品添加剂在食品发酵过程是必不可少的，因此添加不同的食品添加剂会对乳酸菌形成生物膜产生不同的影响。日常生活中最常用常见的食品添加剂是酸味剂和增稠剂，这些添加剂存在不仅使得食品的口感变得更好，还改变了发酵食品中微生物的生存环境。

在任晓镤等[26]对戊糖乳杆菌生物膜形成因素的研究结果中表明，不同的食品添加酸及其不同浓度对乳酸菌的生长和生物膜的形成有着不同的影响。乳酸作为乳酸菌最主要的代谢产物，还用作食品中的酸味剂，它对食品有一定的防腐保鲜的功能，低浓度的乳酸就会抑制乳酸菌形成生物膜。但对于其他的酸味剂柠檬酸、苹果酸、磷酸等，其体积分数必须达到一定程度才会影响乳酸菌的生长及其生物膜形成。

通常为了保持产品的形状，会添加一定的增稠剂，明胶和果胶是最为常见的增稠剂，它们对乳酸菌生物膜的影响各不相同。在张国丽等[29]对植物乳杆菌生物膜形成条件的研究中表明，与明胶相比果胶对生物膜形成有着更强的促进作用。对于果胶来说，生物膜的形成量会随着果胶添加量的增加而增加，但也会存在一个上限，当其添加量大于5.0 mg/mL 时，生物膜的形成量会开始降低。

3 结 语

生物膜的形成可以帮助菌体更好的适应环境，增强自身的免疫能力，帮助其对抗抗生素，从而免于被免疫系统所吞噬[40]。对于益生菌来说，生物膜的存在可以帮助有益微生物抵抗不利环境的胁迫[41]，除此之外，还可以通过生物膜的形成来进行益生菌的聚集，从而使发酵菌种具有更强的稳定性与活性，因此生物膜对于食品的加工和安全有极其重要的研究价值。本文通过对影响乳酸菌生物膜性形成的因素进行综述，希望能为利用生物膜更好地增强乳酸菌的益生活性提供一定的理论依据和研究方向。