解脂亚罗酵母赤藓糖醇发酵过程的研究*

裴疆森，黄玲，张露，田淑斌

1(中国食品发酵工业研究院，北京，100015)2(山东淄博中食歌瑞生物技术有限公司，山东 淄博，255120)

赤藓糖醇是一种天然的多元醇类甜味剂，甜味纯正，热量值接近零，为食品和保健品业者所关注。赤藓糖醇生产菌多来源于自然界分离的耐高渗酵母，如球拟酵母属(Torulopsis)，假丝酵母属(Candida)，丝孢酵母Trichosporonoides，毕赤酵母属(Pichia)，三角酵母属(Trigonopsis)等。此外还有类酵母真菌Monilliella，短柄霉Aureobasidium sp.等。这些菌株可以利用多种底物产生赤藓糖醇，球拟酵母属和汉逊酵母属的酵母以烷烃作为碳源生产赤藓糖醇，本文通过从筛选国内菌种保藏机构保藏的和从自然界分离得到的酵母菌进行赤藓糖醇的发酵试验，期望获得发酵性能更优良的菌种，并开发适合以葡萄糖为原料的赤藓糖醇发酵生产工艺路线。

1 材料与方法

1.1 菌株

使用的酵母菌株购自中国普通微生物保藏中心(CGMCC)和中国工业微生物菌种保藏中心(CICC);自然来源的酵母菌分离自树脂、水果、蜂蜜等来源。

1.2 培养基

酵母分离培养基(YPD)的组成为400 g/L葡萄糖、6 g/L酵母浸出物、10 g/L聚胨的液体培养基;发酵种子培养基的组成为200 g/L葡萄糖、15 g/L酵母浸出物的液体培养基;赤藓糖醇发酵培养基(YDS)的组成为300～400 g/L葡萄糖，5g/L酵母浸出物，5 g/L柠檬酸铵，1 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O 的液体培养基。以上培养基均以自来水配制，灭菌条件为115 ℃，20 min。

1.3 分析方法

赤藓糖醇、葡萄糖采用高效液相色谱法分析。色谱仪:岛津LC-20AD;柱子:Benson BP-100H+碳水化合物柱;流动相:重蒸水，流速:0.8 mL/min;柱温:80℃;检测器:RID-10A示差检测器;进样器:岛津SIL-20A 自动进样器，进样量:20 μL。

1.4 酵母菌种鉴定方法

酵母的生理生化鉴定方法按照文献方法进行［1］;酵母的26S rDNA的D1/D2序列分析方法中的序列PCR扩增的引物设计NL1:5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ’，NL4:5 ’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’，由上海生工合成;PCR扩增条件参照文献进行［2］，扩增产物由诺赛公司测序，序列比对及系统发育分析利用MEGA软件进行。

2 结果与讨论

2.1 不同来源酵母菌株的赤藓糖醇发酵能力比较

对不同来源的耐渗酵母菌，进行了对比摇瓶发酵试验，经过HPLC方法分析，其结果见表1。

表1 不同来源的酵母菌种的赤藓糖醇发酵能力比较Table 1 Erythritol production of yeasts from different sources

从摇瓶发酵结果可知，不同的菌种在高糖条件下的糖醇生产能力存在很大的差异，多数酵母菌会积累一定量的小分子的糖醇物质，但赤藓糖醇的产量普遍不高，只有1株从柑橘中分离得到的编号为Y-22的酵母具有较高的赤藓糖醇产量(见图1)，而且甘油和核糖醇等杂质糖醇的产量很少。

图1 从柑橘中分离得到的酵母Y-22的发酵液的HPLC图谱Fig.1 HPLC diagram of the fermentation liquid with yeast Y-22 isolated from citrus fruit

2.2 Y-22酵母菌种的鉴定

由于赤藓糖醇的主要用途为食用甜味剂，因此有必要对其生产菌种Y-22的分类地位和安全性进行研究和考察。

2.2.1 生理生化鉴定

对酵母Y-22进行常规的生理生化鉴定，其一般的培养特征为:

麦芽汁液体培养基中培养:25℃下培养3 d后，细胞卵形或椭圆形，细胞大小(2～5.5)μm×(3.5～15)μm，有菌膜形成。

麦芽汁琼脂斜面培养:25℃下培养1个月后，菌落奶油酪状，乳白色至灰白色，表面皱褶，边缘波浪状。

玉米粉琼脂Dalmau平板培养:有假菌丝和真菌丝产生。

Y-22的生化实验表明该酵母对所有的碳源均不发酵，而对不同碳源利用性质见表2。

表2 酵母Y-22的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of yeast Y-22

其他生化特性为:裂解熊果苷，-;类淀粉物质的产生，-;同化硝酸盐，-;尿素酶活性，+;无维生素培养基生长，-;37℃下生长，-(+表示该性质为阳性;-表示该性质为阴性)。

2.2.2 分子生物学鉴定

利用引物对酵母菌Y-22的基因组进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，碱基序列为:

GCTCAAATTTGAAACCCTCGGGATTGTAATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCTTGGAATAGTACGTCATAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGTATTGCCTTATCAAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCTAAAGCTAAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGGTGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTGATAGGGAAGGAAATGAGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGCGGTGTACTGCCGACGCCGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAGCGCCTTCGGGCGTTCTCCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCACCCATTTCACCCGTCTTG

经过序列比对和26S rDNA系统发育分析，Y-22酵母菌株与已经发表的解脂亚罗酵母的同源性达到100%(见图2)。

图2 基于Y-22的26S rDNA序列分析构建系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 26S rDNA Y-22 sequence analysis

综合生理生化鉴定结果，可以确定酵母Y-22为1 株解脂亚罗酵母 Yarrowia lipolytica［3］。

2.3 Y-22菌种的生长和发酵条件

在YPD和添加无机盐的YDS等不同培养基中摇瓶培养Y-22酵母时，两者的生长情况差别不大(见表3)。在低糖情况下对数生长期为约10h，细胞倍增时间为约2h。Y-22在YDP固体培养基上培养3d，菌落呈乳白色，表面光滑，边缘光滑;延长培养后菌落表面产生褶皱。Y-22在无氧条件下不生长，在低糖的液体培养基中细胞呈多边生长的椭圆形;在高糖培养基中(培养基中葡萄糖浓度大于250 g/L以上)，细胞基本呈圆形(见图3)，细胞的倍增时间也延长到4 h，说明渗透压对于细胞形态和生长均具有一定的影响。

表3 酵母Y.lipolytica Y-22的摇瓶生长过程(30℃，200 r/min)Table 3 Growth of Y.lipolytica Y-22 in liquid media

图3 Y-22的细胞形态Fig.3 Micro-morphology of yeast L.lipolytica Y-22

由于赤藓糖醇是还原性的代谢产物，相关的氧化还原酶涉及到多种金属离子的辅助因子。根据文献报道［4］，对于酵母 C.magnoliae的赤藓糖醇发酵过程，使用微量的Cu2+可以提高糖醇的产量，对于酵母L.lipolytica Y-22的代谢过程，不同的微量元素对糖醇产量的影响见表4。

表4 微量元素对赤藓糖醇产量的影响Table 4 Effects of trace elements on Y-22 erythritol fermentation

结果表明除了Cu2+对赤藓糖醇的积累有利，Co2+和Fe2+对赤藓糖醇不利外，其他的元素在此浓度下对赤藓糖醇的积累影响不显著。

2.4 解脂亚罗酵母Y-22的赤藓糖醇发酵过程的放大和控制

在摇瓶发酵试验的基础上，还进行了更大规模的赤藓糖醇发酵试验。图4是在5 m3的发酵罐中的赤藓糖醇发酵过程。在30℃下，利用含325g/L的葡萄糖YDS培养基发酵，赤藓糖醇的生产强度可以达到1.17 g/(L·h)。最高糖醇浓度为15.4 g/100 mL，最高转化率为47%，发酵时间为132 h。

图4 5m3发酵罐赤藓糖醇发酵试验Fig.4 Erythritol fermentation process in a 5m3fermentor

为了减少价格昂贵的酵母浸粉的用量，进行了用45g/L的玉米浆(50%固形物含量)替代YDS培养基中的酵母浸出物为培养基的赤藓糖醇发酵试验。初始葡萄糖为336.7 g/L的发酵过程中，可以产生赤藓糖醇153 g/L，转化率为47%，生产强度可达1.6 g/(L·h)(见图5)。但此发酵过程中由于玉米浆的使用会造成大量难以控制的泡沫，而且造成玉米浆中的不溶性残渣较多，对后提取带来较大的影响。加之玉米浆的质量不够稳定，遂在以后更大规模的发酵试验中仍然使用YDS培养基进行Y-22的赤藓糖醇发酵。

图5 5m3上利用玉米浆为氮源进行的赤藓糖醇发酵过程Fig.5 Erythritol fermentation process with CSL substitution for YE medium

赤藓糖醇的发酵是一个严格好氧过程，通过改变搅拌转速和通风量，对发酵过程的溶解氧进行控制，能够显著提高发酵的速率，图7是将DO2控制在约40%的赤藓糖醇发酵过程。当初始葡萄糖为336 g/L，最高赤藓糖醇含量为154.7 g/L，发酵时间为116 h，生产强度从对照的1.17 g/(L·h)提高到了1.33 g/(L·h)。

由于酵母细胞在高渗环境中的生长和发酵都受到一定的抑制，为了缩短赤藓糖醇的发酵周期，提高生产效率，在发酵过程中尝试采用葡萄糖分批流加的发酵方式，即降低起始葡萄糖，然后中途不断补加高浓葡萄糖以提高产物的积累。试验发现由于起始葡萄糖浓度的适当降低，葡萄糖在前期的消耗速率达到了5.5 g/(L·h)，赤藓糖醇的积累速率也达到了1.76 g/(L·h);在后期的流加阶段，葡萄糖的消耗速率达到了2.5 g/(L·h)，而赤藓糖醇的积累速率为1.5 g/(L·h)，前期和后期的转化率差别很大，分别为32%和63%(图7)。故为了实现转化效率和转化率的同步提高，还需要对流加策略进行进一步优化。

图6 50 m3罐溶解氧控制条件下的赤藓糖醇发酵过程Fig.6 Erythritol fermentation process in 50 m3 fermentor with controlled DO level

图7 葡萄糖流加过程对赤藓糖醇发酵的影响Fig.7 Fed-batch erythritol fermentation process

3 讨论

赤藓糖醇是酵母通过HMP途径产生的一种小分子多元醇，用以平衡胞外的高渗透压环境，其大致的代谢过程如图8所示，6-磷酸葡萄糖经过6-磷酸葡萄糖脱氢酶(ZWF1)作用生成6-磷酸葡萄糖酸，进入HMP途径。再经过转酮基酶(TKL)和转醛基酶(TAL)的作用得到4-磷酸赤藓糖，再经过去磷酸化和赤藓糖还原酶(ER)的作用产生赤藓糖醇。

赤藓糖醇是一种4碳糖醇，可能由于从6碳糖合成的分子得率比合成3碳的甘油要低，故在耐高渗酵母中产赤藓糖醇的菌种远比产甘油的少［5］，高产的菌株则更少。从天然来源分离得到的酵母菌Y-22经过生理生化鉴定和分子生物学鉴定为一株解脂亚罗酵母，这与可以利用正构烷烃合成赤藓糖醇的菌种属于同一种［6］。

解脂亚罗酵母是在自然界很常见的一种非致病性酵母菌种，常见于奶酪［7-8］等发酵食品中。由于解脂亚罗酵母是一种专性好氧的非发酵性酵母菌种，故发酵过程中不产生乙醇等酵解副产物，对进一步提高发酵过程的糖醇转化效率有利。解脂亚罗酵母Y-22的赤藓糖醇可以葡萄糖为碳源，在好氧的条件下高效产生赤藓糖醇。发酵过程明显分为对数生长段和后期稳定段。在对数生长段，细胞生长旺盛，氧气消耗很快，而糖醇只是在该阶段的后期才开始积累。在后期稳定段，细胞生长和氧气消耗均趋于平缓，而葡萄糖的消耗和赤藓糖醇的积累却延续对数生长期后段的趋势，这说明赤藓糖醇的发酵过程是非生长偶联的代谢过程。

在赤藓糖醇发酵过程控制方面，氮源的种类对Y-22菌种的发酵性状有一定的影响，控制溶解氧的水平对于维持发酵速度有很大的帮助，溶解氧控制在10% ～40%对发酵有利。在不同规模发酵水平上，解脂亚罗酵母Y-22的发酵转化率可以达到约50%。通过图8对酵母的赤藓糖醇发酵过程进行化学计量和辅酶平衡方面的分析，在理想状况下，酵母细胞利用葡萄糖合成赤藓糖醇为唯一产物时的赤藓糖醇的理论分子收率可达到1∶1.33，相当于90%质量转化率。而实际上，由于磷酸戊糖途径的其他副产物的产生及C3化合物进入TCA循环被氧化为CO2造成碳损失，赤藓糖醇的转化率远低于理论最大值，这为进一步通过代谢工程改造提高赤藓糖醇的转化率提出了目标。

图8 酵母合成赤藓糖醇的代谢途径Fig.8 Metabolic pathway of erythritol bio-synthesis in yeast cells

本文从自然界分离得到的Y-22酵母菌在小试和大规模发酵过程中均表现出良好的赤藓糖醇发酵性能，具备相当的产业化应用价值。

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