N掺杂改性P25抑菌材料的制备及其可见光催化抑菌活性的研究*

李莹影，宋贤良，张静

(华南农业大学 食品学院，广东广州，510642)

我国果蔬的品种和产量均居世界之首，然而因保鲜技术落后，每年造成大量的果蔬腐烂变质，经济损失巨大［1］。因此，探寻高效的果蔬贮藏保鲜新技术一直是人们研究的热点。采后果蔬在贮藏过程中易受微生物侵染，发生生理和化学败坏是导致其腐烂变质的主要原因［2］。纳米TiO2作为一种新型的光催化抗菌材料，具有广谱抗菌性能以及良好的阻隔和力学性能，在贮藏保鲜方面具有潜在的应用前景［3-7］。

但是纳米TiO2只有在紫外光激发下才表现出较强的光催化抗菌活性，使其在果蔬保鲜中的应用受到限制［8-10］。研究表明，非金属元素掺杂改性能够将TiO2的光响应范围拓宽到可见光区域［11-13］，增强其对可见光的利用效率，从而提高材料的光催化性能，其中N掺杂被认为是一种有效的方法［14-15］。

本研究以商业纳米TiO2(P25)为材料，采用非金属元素N进行掺杂改性以提高其可见光响应活性，详细研究了改性P25-N粉体对大肠杆菌的抑菌效果。通过研究既能为果蔬贮藏保鲜技术开辟新的途径，又能为具有抗菌功能的新型保鲜材料的研究开发提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

主要试剂:大肠杆菌(Escherichia coli，O78，华南农业大学微生物实验室)，P25(德国Degussa公司)，脲、乙醇、NaOH(分析纯，广州化学试剂厂)。

主要仪器:座式自动电热压力蒸汽灭菌锅(DX-35BI)，上海申安医疗器械厂;生化培养箱(LRH-250A)，上海一恒科学仪器有限公司;超净工作台(SW-CJ-IFD)，苏州安泰空气技术有限公司;真空煅烧炉(SK-G014143)，天津市中环实验电炉有限公司;水浴恒温振荡器(SHA-C)，金山市华峰仪器有限公司;752N紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;光催化抑菌反应器，华南农业大学机械实验室。

1.2 大肠杆菌标准曲线绘制

参照本课题组张静等所采用的方法［16］:用稀释平板菌落计数法得出摇床培养的新鲜菌液的菌浓度，将其按10倍稀释法得到一系列已知菌浓度的菌悬液样品，在600 nm处用紫外可见分光光度计测定各样品的OD值，以光密度(OD值)为横坐标，以菌浓度(CFU/mL)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3 N掺杂P25(N-P25)抑菌材料的制备

称取定质量的P25粉末于玛瑙研钵中，再加入一定量的脲粉末，将二者研磨混合，至于80℃烘箱过夜，转移真空煅烧炉中，在设定的温度与时间下煅烧，冷却后取出，研磨得淡黄色粉末。

在煅烧温度为400℃，煅烧3 h的条件下，按上述的方法制备2 g P25粉体脲掺杂量分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g 的改性 N-P25抑菌材料。

在煅烧时间为3 h，2 g P25掺杂8 g脲的条件下，按上述的方法制备煅烧温度分别为350，400，450，500，550，600 ℃的改性 N-P25抑菌材料。

在煅烧温度为400℃，2g P25掺杂8g脲的条件下，按上述的方法制备煅烧时间分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h 的改性 N-P25抑菌材料。

1.4 可见光催化抑菌活性测定

在严格保证无菌条件下，在超净工作台中将1 mL 105CFU/mL的菌悬液与1 mL生理盐水加入8 mL生理盐水试管中作为空白对照组，将1 mL 105CFU/mL的菌悬液与1 mL 1.0 g/L改性光催化剂悬浊液加入8 mL生理盐水试管中作为实验组。将其置于涡流振荡器中，振荡使其混匀，再将其转移至的光催化抑菌反应器中进行抑菌试验。反应器光源为85WE27-白光6 400 K普通荧光灯，开始光照并计时，每隔20 min取样100 μL涂布于LB固体培养基平板中(分别做3个平行)，倒置恒温培养(细菌37℃培养)，计算菌落数，计算抑菌率。抑菌率计算:

式中，K-抑菌率;C0-空白对照组光照后存活的菌量;C-实验组光照后存活的菌量。

1.5 N掺杂改性P25抑菌材料灭活大肠杆菌二次旋转回归试验

在单因素实验的基础上，根据响应面中心组合实验设计原理，设计了3因素3水平的二次旋转回归实验，以可见光条件下N-P25改性抑菌材料对大肠杆菌抑菌效果为考察指标，对N-P25改性抑菌材料的制备条件进行优化。中心组合实验因素与水平设计如表1所示。

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Factors associated with the level of response surface analysis table

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌标准曲线

见本课题组张静等所作的标曲［16］，以光密度(OD值)为横坐标，以菌浓度(CFU/mL)为纵坐标，绘制标准曲线。所得回归方程为:y=2×109X-2×108，R2=0.999 5，说明线性拟合程度良好。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 脲掺杂量对N掺杂改性P25材料可见光催化抑菌活性的影响

由图1可知，随着脲掺杂量的增加，N-P25材料抑菌率先呈上升趋势，在脲掺杂量为2～8 g/g P25，抑菌率快速提高，但当脲掺杂量大于8 g/g P25后，抑菌率几乎没变，故取最佳脲掺杂量8 g/g P25。这可能由于掺杂浓度较高时，有利于生成新的电子-空穴的复合中心，增大其复合几率［17］;而过高的掺杂浓度有可能使N元素在TiO2中达到饱和而产生新相［18］，减少TiO2有效表面积和对光的吸收，从而降低光催化效率。

图1 不同硫脲掺杂量下改性P25-N材料的抑菌率Fig.1 Antibacterial rate of modified P25-N material in different thiourea doping amount

2.2.2 煅烧温度对N掺杂改性P25材料可见光催化抑菌活性的影响

由图2可知，N-P25材料抑菌率随煅烧温度的升高呈逐渐增加的趋势，在550℃抑菌率最高。高温煅烧使更多的N元素掺入二氧化钛晶体中，形成杂质置换缺陷，这个置换缺陷的存在可扩大激发波长的范围，提高光催化反应效率，从而提高N-P25材料抑菌率。550℃以后，N-P25材料抑菌率随着温度的升高开始下降，这是因为纳米二氧化钛部分锐钛矿晶型转化为金红石晶型。掺杂元素的存在会影响温度对TiO2晶型转化的作用，这可能是导致煅烧温度对N-P25材料抑菌率产生不同影响的原因［19］。

图2 不同煅烧温度下改性P25-N材料的抑菌率Fig.2 Antibacterial rate of modified P25-N material at different calcining temperature

2.2.3 煅烧时间对N掺杂改性P25材料可见光催化抑菌活性的影响

由图3可知，随着煅烧时间的增加，N-P25材料的抑菌率呈先升高后降低趋势，煅烧时间为1.5 h时NP25材料的抑菌率最高。这是因为短时间的煅烧可以提供适当的动能加速分子无序运动从而使得N元素掺入二氧化钛晶体中，而长时间的煅烧会提供过量的热能使得掺入二氧化钛晶体中N元素部分逸出，减少二氧化钛晶体中N元素掺杂量。另外，煅烧时间过长会导致TiO2的锐钛矿相和金红石相晶体粒径不同程度的增大［20］。

图3 不同煅烧时间下改性P25-N材料的抑菌率Fig.3 Antibacterial rate of modified P25-N material at different calcining time

2.2.4 空白对照试验

由图4可知，随着光照时间的增长，无光照组和空白组大肠杆菌菌落数无明显变化，而P25抑菌材料的抑菌率呈持续上升趋势，最高可达79%。表明P25材料只有在光照条件下才能发挥抑菌性，光能激发是P25发挥抑菌性的必要条件。

图4 P25抑菌材料在可见光下对大肠杆菌的抑菌性Fig.4 Antibacterial rate of P25material in the visible light

由图5可知，随着光照时间的增长，无光照组和空白组大肠杆菌菌落数无明显变化，而N-P25材料组的抑菌率呈持续上升趋势，其在可见光条件下对大肠杆菌的抑菌率最高可达90%，相对P25在可见光条件下79%的抑菌率有较大的改善，这表明采用研磨煅烧法用脲对P25材料进行改性可提高材料抑菌率。

图5 不同材料在可见光下的抑菌率Fig.5 Antibacterial rate of different material in the visible light

2.3 二次旋转回归设计试验结果

对抑菌材料制备工艺中的煅烧温度A、煅烧时间B和脲掺杂量C三个因素做二次旋转回归试验，试验结果如表2所示。

表2 改性P25-N材料灭活大肠杆菌二次旋转回归设计试验结果Table 2 Experiment result of secondary rotation regression design on inactivated E.coli of modified P25-N material

Design expert程序对结果进行回归分析，得出NP25改性材料对大肠杆菌抑菌率Y的回归模型方程为:

Y=91.7-1.57A+1.3B+2.62C-0.48AB-1.73AC-0.43BC-7.31A2-0.51B2-1.61C2

对回归方程进行方差分析，所得结果见表3。方差分析表3中F值为20.61，说明模型显著，未知因素对试验结果干扰很小，说明所选的二次回归模型是适当的。模型Pr＞F=0.000 3＜0.05，说明所建立的二次回归模型极显著，表明回归方程拟合程度较好，可以对模型进行预测。条件(Pr＞F)＜0.05表明该条件是显著条件，复相关指数为0.963 6，说明该数学模型各因素对抑菌率的影响占96.36%。对各试验因子的的偏回归系数的检验结果表明:A2、C的偏回归系数达到极显著水平(P＜0.01);A、B、AC、C2的偏回归系数达到显著水平(0.01＜P＜0.05)。

表3 模型方差分析和显著性检验结果Table 3 Results from model variance analysis and significance test

根据二次回归的数学模型分析结果，最优条件为掺杂量为8.72 g，煅烧温度548.27℃，煅烧时间为1.87 h。考虑到实际可操作性，最终选取掺杂量为8.70 g，煅烧温度548℃，煅烧时间为1.9 h。

3 结论

根据二次回归模型分析结果可知，改性P25-N材料的最佳制备条件为:脲掺杂量8.70 g/g P25，煅烧温度548℃，煅烧时间为1.9 h。可见光条件下，改性P25-N材料对大肠杆菌的抑菌率为90%，较未改性的P25材料抑菌率(79%)提高了11%，说明通过N掺杂改性，可以P25提高其对光照的吸收能力，增强其可见光催化抑菌性，这为TiO2运用于制备抑菌性水果包装膜技术提供了可能。

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