迷迭香精油对油炸牛干巴中丙烯酰胺的影响及热处理条件优化

曾源，贾兴，韦良东，王乃富

(安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥，230000)

牛干巴是云南回族的一种传统民族肉制品，它以屠宰黄牛后腿肉为主要原料，并辅以其他香料，经腌制、晾晒、挤压、风干、切片、真空包装而成［1］。油炸是加工牛干巴最常见的方式，虽然牛干巴以独特的风味，丰富的营养深受人们的喜爱，但其中丙烯酰胺对人体的危害不容忽视。Tornquist等发现，一些普通食品在经过煎、炸、烤等高温加工处理时产生丙烯酰胺［1］，它是一种公认的神经毒素，可以引起人体和动物神经系统(主要是外周神经)的损害，并具有较强的组织渗透性，可以通过未破损的皮肤、黏膜、肺和消化道进入人体，经口摄入被认为是人体吸收丙烯酰胺最快速和最完整的途径［2］，且其含量会随加工温度的升高而增加［3］。

目前抑制丙烯酰胺产生的方法有很多，主要有控制丙烯酰胺前体物天冬酰胺以及还原糖的含量，改善热加工条件及方法，以及使用添加剂，在针对那些还原糖以及天冬酰胺含量较少的食物中(主要是肉类食物)，使用合适的天然抗氧化剂是抑制丙烯酰胺产生的一个最重要的途径，尤其是香辛料精油，它以其独特的香气以及抗氧化活性在抑制丙烯酰胺生成方面有很大的优势［4］。

目前科研人员对丙烯酰胺的研究主要针对植物淀粉类食品，对动物类食品的研究很少，因此对油炸肉类食品中丙烯酰胺的研究显得很有必要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 牛干巴样品

购于云南省昆明市沃尔玛超市(牛干巴成熟1个月)。

1.1.2 煎炸用油

香满园大豆油，购于云南省昆明市沃尔玛超市。

1.1.3 香辛料精油

迷迭香精油，水蒸气蒸馏法提取。

1.1.4 试剂

L-天冬酰胺，聚乙二醇，丙烯酰胺标准样品，Fe-SO4，水杨酸钠，H2O2，HCl，邻苯三酚，Tris-HCl缓冲液，无水 Na2SO4，体积分数95%乙醇、KOH、NaOH、酚酞、KI、三氯甲烷、冰乙酸、Na2S2O3、EDTA、淀粉等试剂，均为分析纯。

1.1.5 主要仪器与设备

Agilent1210高效液相色谱仪，美国安捷伦公司;ICS2500型离子色谱仪，美国戴安公司;micrOTOF-Q II高分辨质谱仪(配电喷雾离子源)，德国Bruker公司;UNICO 7200紫外可见分光光度计，美国;中兴牌101电热鼓风干燥箱，上海实验仪器厂有限公司;TGL-16C高速离心机，上海安亭科学仪器厂;DS-1高速组织捣碎机，上海启前电子科技有限公司;HH-1恒温油浴锅，常州澳华仪器有限公司;SHA-BA恒温振荡器:常州澳华仪器有限公司;METTLER TOLEDO-FE20 pH计，瑞士;DENVER INSTRUMENT TD-114电子分析天平，美国丹佛仪器公司;DRAGON LAB均质机，上海人和科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 油炸牛干巴的制作

新鲜水牛肉→修割整理→称重→擦腌制料→搓揉→入盆压实→封口→入库腌制→出库→风干→生牛干巴→切片(1cm×2cm×1cm)→油炸(恒温油浴锅调控特定时间，特定温度)

腌制料配方:盐3%，糖0.5%，亚硝酸盐0.006%。

1.2.2 不同浓度的迷迭香精油对牛干巴丙烯酰胺含量的影响

将浓度分别为0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的迷迭香精油添加至煎炸大豆油中，牛干巴油炸时间2.5 min，油炸温度170℃。

1.2.3 不同浓度的迷迭香精油溶液的配制

迷迭香精油浓度梯度为0.0%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%即采用微量进样器在25 mL的无水乙醇溶液中分别加入0，0.025，0.05，0.075，0.1 mL 的迷迭香精油，混匀。

1.2.4 香辛料精油体外抗氧化活性的测定

1.2.4.1 清除DPPH自由基能力的测定

取0.4 mL一定浓度的样品溶液，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，混匀，暗处放置30 min，并不断振荡，在517 nm处测定其吸光度，0.4 mL样品溶液+2 mL乙醇为样品对照，0.4 mL蒸馏水+2 mL乙醇为空白调零，0.4 mL蒸馏水+DPPH乙醇溶液为对照［5］。清除率计算公式为:

清除率/%=［A对照-(A样品-A样品对照)/A对照］×100

1.2.4.2 清除羟自由基能力的测定

在9支试管中加入浓度均为0.15 mol/L FeSO4，2 mmol/L水杨酸钠1 mL，在其4支试管中分别加入不同浓度的样品溶液1 mL，最后加6 mmol/L H2O21 mL启动反应，定容至10 mL，37℃水浴反应1 h，以蒸馏水为参比，测定510 nm处的吸光值［6］。

抑制率/%=［A0-(Ai-Ai0)］/A0×100

式中，A0，用蒸馏水代替样品的对照值;Ai，加样后的吸光度;Ai0，样品本身的吸光度。

1.2.4.3 清除超氧阴离子能力的测定

取4.5 mL pH 8的2.5 mmol/L Tris-HCl缓冲液，1.0 mL不同浓度的样品溶液，2.4 mL蒸馏水，混匀后在25℃水浴中保温20 min，取出后立即加入在25℃预热过后的3 mmol的邻苯三酚0.1 mL，迅速摇匀后倒入比色杯，于325 nm下每隔30 s测定吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加，并计算抑制率［7］。

抑制率/%=(DA0-DA)/DA0×100

式中:DA0，产邻苯三酚的自氧化速率;DA，加入精油溶液后邻苯三酚的自氧化速率。

单位均为吸光度每分钟的增值。

1.2.5 迷迭香精油抑制牛干巴丙烯酰胺生机理分析

1.2.5.1 迷迭香精油直接对丙烯酰胺含量的影响

3 mL不同浓度精油乙醇溶液与1 mL 200 mg/L的丙烯酰胺乙醇溶液反应(添加0.1%H2O2溶液做为对照)在聚乙二醇浴160℃反应10 min，立即冰浴，0.45 μm微孔滤膜过滤，HPLC法测定体系中丙烯酰胺的生成量［8］。

1.2.5.2 迷迭香精油对天门冬酰胺含量的影响

5 mL不同浓度样品溶液(添加0.1%H2O2溶液做为对照)分别加入在1 mmol天门冬酰胺的模拟体系中(在不锈钢试管发生反应)，并在160℃聚乙二醇浴下反应20 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，计算天门冬酰胺生成量［9］。

1.2.5.3 迷迭香精油对煎炸大豆油体系羰基化合物含量的影响

将浓度分别为 0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的迷迭香精油5 mL添加至170℃煎炸大豆油中，并反应3 min，分别取其5种油样，测其羰基化合物含量，测定方法参照GB/T 5009.37-2003食用植物油卫生标准的分析方法。

1.2.6 单因素实验

选择影响牛干巴丙烯酰胺含量的3个主要因素进行单因素实验。

牛干巴浸泡溶液pH的选择:0.5%柠檬酸，蒸馏水，0.1%NaOH 调节 pH 值为 5.5、6、6.5、7、7.5(油炸温度170℃，油炸时间2.5 min)。油炸温度的选择:120、150、170、200、220 ℃(浸泡溶液 pH 6.5，油炸时间 2.5 min)。油炸时间的选择:1.5、2、2.5、3、3.5 min(浸泡溶液pH 6.5，油炸温度170℃)。

1.2.7 响应面实验

采用Box-Behnken法，根据单因素实验选择最佳的因素和水平，以牛干巴丙烯酰胺含量为响应值，选择最适浸泡溶液，油炸温度及油炸时间。

1.2.8 牛干巴样品前处理条件

称取粉碎后的牛干巴样品2 g，置于30 mL离心管，加10 mL甲醇，均质3 min，取上清液5 mL，离心10 min，取上清液加卡瑞试剂1，2 各100 μL，离心15 min(10 000 r/min)，取2.5 mL上清液，(若除油，加7.5 mL正己烷，振荡2 min，移去上层正己烷)，氮吹干，加0.5 mL蒸馏水振荡2 min，过C18小柱(过柱前先经过1 mL甲醇和1 mL水活化小柱)，舍弃前5滴后，收集过滤后的样液，并用1.5 mL蒸馏水洗脱，收集洗脱液，最后过0.45微孔滤膜，即可进样。

1.2.9 丙烯酰胺含量的测定(LC-MS/MS)

色谱条件:色谱柱为ZORBAX SB-Aq C18(150 mm×4.6 mm);流动相为0.1甲酸水溶液;检测波长为198 nm;流速为0.6 mL/min;柱温为25℃;进样量为 10 μL。

质谱条件:检测方式:选择反应监测EIC;离子源温度:室温;扫描模式:ESI+;喷雾电压:4 500 V;鞘气电压(N2)(bar):0.4;辅助气(N2):4 L/min碰撞气Ar:8×105Pa;毛细管温度:180℃;离子源温度:室温;丙烯酰胺定量离子为m/z 72、55，定性离子为m/z 72、27;同位素内标［D3］-丙烯酰胺定量离子为 m/z 75、58，定性离子为 m/z 75、30，碰撞能量(E/V):40。

1.2.10 天门冬酰胺的测定

参考欧仕益的方法［10］。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的香辛料精油对牛干巴丙烯酰胺含量的影响

图1显示，随着迷迭香精油浓度的升高，牛干巴丙烯酰胺的含量呈明显下降的趋势，浓度达到0.4%以上时，丙烯酰胺的含量趋于稳定，因此可以推断，迷迭香精油可以作为抑制丙烯酰胺生成的添加剂。

图1 不同浓度的迷迭香对牛干巴丙烯酰胺含量的影响Fig.1 Effects of different concentrations of rosemary on acrylamide levels in dried beef

2.2 迷迭香精油清除自由基能力与其丙烯酰胺抑制率的关系(表1)

表1 迷迭香精油清除自由基能力与其丙烯酰胺抑制率的关系Table 1 Rosemary essential oil and its ability to clear the relationship between acrylamide radical inhibition rate

2.3 迷迭香精油清除自由基能力与其丙烯酰胺抑制率的相关性分析

由表2可知，迷迭香精油对超氧阴离子自由基清除率与丙烯酰胺抑制率的相关性最高(r=为0.909)，其次是羟自由基清除率(r=0.884)而与DPPH自由基清除率相关性最小(r=0.836)，由此可以推断迷迭香精油的体外抗氧化活性与其丙烯酰胺抑制率存在很显著的相关性。

表2 迷迭香精油清除自由基能力与其丙烯酰胺抑制率的相关性分析Table 2 The correlation analysis of rosemary essential oils to clear free radicals and their ability to inhibit the rate of acrylamide

2.4 香辛料精油抑制牛干巴丙烯酰胺产生机理分析

由表3可知，不同浓度的的迷迭香精油直接与丙烯酰胺反应后，丙烯酰胺的含量并没有发生太大的变化，说明迷迭香精油并不直接与丙烯酰胺反应，另一方面不同浓度的香辛料精油在与0.1%H2O2混合后，再与丙烯酰胺直接反应，丙烯酰胺的含量都有不同程度的减少，说明迷迭香精油的氧化产物可以通过直接破坏丙烯酰胺达到抑制的目的。随着迷迭香浓度的升高，与之反应的天冬酰胺的含量逐渐减少，说明迷迭香精油可通过竞争丙烯酰胺的前体物质即天冬酰胺，而减少丙烯酰胺的含量。羰基价反映的是煎炸油在高温下产生的总羰基类化合物含量，从表3可以看出，羰基价与迷迭香精油的添加量呈良好的线性趋势，可以推测迷迭香精油对丙烯酰胺的另一个抑制机理可能是其含有可以捕捉羰基类化合物的物质［11］。

表3 香辛料精油抑制牛干巴丙烯酰胺产生机理分析Table 3 Theanalysis of the formation mechanism of acrylamide that sim feed oils inhibit it in dried beef

2.5 油炸温度，油炸时间以及浸泡溶液pH的单因素实验

由图2可知，在120～170℃内，随着温度的升高，丙烯酰胺的含量逐渐升高，170～200℃内，随着温度的升高，丙烯酰胺的含量逐渐减少，在200℃以后，丙烯酰胺含量有轻微的上升趋势。在温度高于120℃的煎炸大豆油中，不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸都会被氧化分解，不饱和脂肪酸氧化先产生一级氧化产物氢过氧化物，而氢过氧化物不稳定会产生次级代谢产物如醛、酮、醇类化合物，这些含有羰基的化合物可能形成丙烯酰胺，饱和脂肪酸氧化反应的大多数的分解产物为醛和甲基酮以及少量的醇与γ-内酯，而这些产物也有重新合成形成AA的可能性，但当温度过高时，生成的丙烯酰胺会发生一定程度的降解［12］。

图2 油炸温度与牛干巴丙烯酰胺含量的关系Fig.2 Relationship between frying temperature and acrylamide levels in dried beef

由图3可知，在1.5～2.5 min内，随着油炸时间的增加，丙烯酰胺的含量逐渐升高，在2.5～3 min内，随着油炸时间的增加，丙烯酰胺的含量逐渐减少，3 min以后又有增长的趋势。除了上述煎炸大豆油降解产物生成丙烯酰胺以外，通过丙烯醛、丙烯酸生成丙烯酰胺也是一个主要途径［13］，牛干巴中的蛋白质和碳水化合物在高温分解反应中，都会产生大量的小分子醛类物质，而丙烯醛经由直接氧化反应生成丙烯酸，丙烯酸再与氨反应，最终生成AA;丙烯醛也可直接与Asn反应形成N-糖苷，而后转化成AA，重新化合生成丙烯醛，进而生成丙烯酰胺［14］。

图3 油炸时间与牛干巴丙烯酰胺含量的关系Fig.3 Relationship between frying time and acrylamide levels in dried beef

由图4可知，浸泡溶液在弱酸性的条件下，牛干巴丙烯酰胺的含量最少，在弱碱性条件下，丙烯酰胺含量达到最高。适当调节牛干巴基质的pH值可以抑制丙烯酰胺的形成降低食品体系的pH值可使天冬酰胺分子中的α-氨基质子化［15］，降低了与碳水化合物发生亲核加成反应的可能性，从而阻止了丙烯酰胺的形成通过降低pH值，柠檬酸可能使牛干巴中游离的非质子化的胺(—NH2)转换成质子化的胺离子(—NH3+)，从而在第一步就阻止了美拉德反应中丙烯酰胺的形成［16］。

图4 浸泡溶液pH值与牛干巴丙烯酰胺含量的关系Fig.4 Relationship between pH of the solution soak and acrylamide levels in dried beef

2.6 响应面实验优化最佳加工条件

以牛干巴丙烯酰胺的含量为响应值，以单因素试验结果为基础，拟定试验因素水平见表4，试验结果见表5。经回归拟合后，试验因子对响应值的影响可以用以下回归方程表示:

表4 Box-Behnken Design实验因素与水平Table 4 Levels of the variables in the Box-Behnken design

表5 Box-Behnken Design实验设计与结果Table 5 Experimental design and results of Box-Benhnken Design

Y=57.28-1.10A+0.75B+2.50C-0.20AB-0.20AC+0.52BC-4.71A2-1.27B2-0.75C2

由表6可知，所选模型的不同处理间差异极显著(P＜0.01)，说明用回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其应变量与全体自变量之间的线性关系显著，即该试验方法可靠。失拟项0.721 8＞0.05，说明该方程对试验拟合情况好，试验误差比较小。单一因素pH，油炸温度，油炸时间对丙烯酰胺含量的影响是极显著的，交互项中BC，影响显著，说明油炸时间和油炸温度之间的交互作用显著，能显著影响油炸薯条中丙烯酰胺的生成量;AB，AC的影响不显著，说明浸泡溶液pH和油炸时间之间、浸泡溶液pH和油炸温度之间都没有交互作用。

表6 响应面二次回归模型方差分析Table 6 ANOVA for response surface quadratic model

该方程的决定系数R2=99.37%，表示方程拟合度良好。C·V表示试验的精确度，本实验C·V=0.74%，试验可靠。

2.7 响应面图与等高面图分析

根据上述回归方程及回归模型方差分析表绘出响应面图和等高图，见图5～图7。从响应面立体分析图可知，响应面立体分析图开口向下，当响应值增大到极值以后，随着各因素的增大，响应值逐渐减少，经过修正，选择浸泡溶液pH 6.90，油炸温度198℃，油炸时间1.6 min，在此条件下，牛干巴丙烯酰胺含量达到了 48.5 μg/kg。

图5 油炸温度和pH对牛干巴中丙烯酰胺含量影响的响应面图和相应等高图Fig.5 Frying temperature and pH on acrylamide levels in dried beef on the response surface map and the corresponding contour map

图6 油炸时间和pH对牛干巴中丙烯酰胺含量影响的响应面图和相应等高图Fig.6 Frying time and pH on acrylamide levels in dried beef on the response surface map and the corresponding contour map

图7 油炸温度和油炸时间对牛干巴中丙烯酰胺含量影响的响应面图和相应等高图Fig.7 Frying time and Frying temperature on acrylamide levels in dried beef on the response surface map and the corresponding contour map

3 结论与讨论

牛干巴丙烯酰胺含量会随着迷迭香精油浓度的升高而逐渐降低，迷迭香精油的体外抗氧化活性与牛干巴丙烯酰胺含量有着很显著的相关性，且DPPH自由基的清除率与丙烯酰胺抑制率的相关性最高(相关系数为0.909)，迷迭香精油并不直接与丙烯酰胺反应，但其氧化产物可以通过直接破坏丙烯酰胺达到抑制的目的，迷迭香精油也可以通过竞争丙烯酰胺的前体物质即天冬酰胺，从而减少丙烯酰胺的含量，另一个对丙烯酰胺的抑制机理可能是其含有可以捕捉羰基类化合物的物质。响应面法优化得出最适处理方法:浸泡溶液pH 6.90，油炸温度198℃，油炸时间1.6 min，在此条件下，牛干巴丙烯酰胺含量达到了48.5 μg/kg。

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