白鲢中盐溶蛋白提取工艺优化及其加工特性研究*

雷颂，窦建洲，梅志方，杨品红，王伯华

(湖南文理学院生命科学学院，水产高效健康生产湖南省协同创新中心，环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室，湖南常德，415000)

我国淡水鱼产量稳居世界高位，并保持每年5%的增长势头。但目前我国淡水鱼资源浪费严重，产品开发利用与加工水平不高，淡水鱼的加工利用只占到总鱼量5%左右，而且其中绝大多数为冷冻冷藏及冰鲜品，深加工产品仅占很小的一部分［1］。鲢鱼，四大家鱼之一，又名白鲢，属于鲤形目，鲤科。白鲢新鲜食用因其具有土腥味、骨刺多，销路受到局限，经济效益低其附加值还没有真正完全发掘出来。

盐溶蛋白(salt soluble proteins，SSP)又称肌原纤维蛋白［2］，是肌肉中最重要的蛋白质，是决定肉制品品质的最主要的蛋白，约占总蛋白含量的50% ～60%。研究表明盐溶性蛋白性质对鱼肉的保水性、胶凝性等加工特性影响甚大［3］。盐溶性蛋白质中的几种重要蛋白质如肌球蛋白、机动蛋白及机动球蛋白的凝胶机理已研究的较为清楚。目前，对猪肉、牛肉、鸡肉以及海水鱼的盐溶性蛋白做了较为详细的研究，而针对淡水鱼盐溶性蛋白热诱导凝胶保水性及其乳化性等加工特性的研究相对较少。深入研究白鲢盐溶蛋白的功能性质能促进白鲢的深加工和新产品开发，创造营养价值高、安全天然的食品，提高白鲢的附加值、改善鲜销压力大的状况具有重要的意义。

本试验以鲜活鲢鱼为研究对象，优化其盐溶蛋白提取条件，并对盐溶蛋白热诱导凝胶保水性以及盐溶蛋白乳化性等加工特性进行研究，并探讨其用作高档天然肉糜制品品质改良剂的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验原料及主要试剂

鲜活白鲢，购自生鲜市场(质量在1～1.25 kg/条);一级大豆油，购自嘉里粮油(深圳)有限公司。

NaOH、NaCl、KI、CuSO4·5H2O、四水合酒石酸钾钠、HCl、Na2HPO4、NaH2PO4、三聚磷酸钠，天津市科密欧化学试剂有限公司，均为分析纯;标准牛血清白蛋白，北京驰明瑞生物科技有限公司;十二烷基磺酸钠(SDS)，生兴生物技术(南京)有限公司，分析纯。

1.2 实验设备

LD4-2A低速离心机，北京医用离心机厂;JJ-2组织捣碎匀浆机，富华仪器有限公司;DELTA320 pH计，梅特勒-托丽多仪器(上海)有限公司;AL204电子分析天平，梅特勒-托丽多仪器有限公司;C12型绞肉机，广东省韶关市新通力食品机械有限公司;BCD-257SL冰箱，青岛海尔股份有限公司;721N可见光分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司;ULTRA-TURRAX T25型高速分散仪，IKA仪科有限公司。

1.3 实验方法

盐溶蛋白的提取:取鲢鱼背肉，剔出红色肉，用绞肉机绞碎，称取每份25 g，真空包装后在-18℃下冻结，备用。提取盐溶蛋白时，先将冷冻样品在4℃下解冻，加入4倍质量0～4℃的蒸馏水，用高速组织捣碎机匀浆(6 000 r/min，5 min)。再转入离心管中，离心(3 000 r/min，10 min)，去除上清液，重复1次，向沉淀中加入不同提取条件的 NaCl溶液，匀浆液在4℃静置25 h后，纱布初滤，滤液经(4 000 r/min，30 min)后得到上层溶液即为盐溶蛋白质溶液。

单因素试验:在固液比为1∶4(g∶mL)、提取液pH值为6.5、浸提时间为25 h的条件下，设置盐浓度(mol/L)0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 七个梯度进行试验，测定盐浓度对盐溶蛋白得率的影响;在NaCl浓度为0.6 mol/L、提取液 pH值为6.5、浸提时间为25 h的条件下，设置固液比(鱼肉与添加溶液的比例，g∶mL)1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 五个梯度进行试验，测定固液比对盐溶蛋白得率的影响;在NaCl浓度为 0.6 mol/L、固液比1∶4、提取液 pH为6.5的条件下，设置浸提时间为5、10、15、20、25、30六个梯度进行试验，测定浸提时间对盐溶蛋白得率的影响;在NaCl浓度为0.6 mol/L、固液比1∶4、浸提时间为 25 h，设置浸提 pH 值为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0五个梯度进行试验，测定浸提 pH对盐溶蛋白得率的影响。

提取工艺的优化:采用正交试验法，通过以上单因素实验设计出正交试验如表1所示。

表1 正交因素实验水平Table1 Factors and levels for the orthogonal test

蛋白质含量的测定采用双缩脲法，以BSA(牛血清白蛋白)作为标准蛋白。

盐溶蛋白热诱导凝胶的制备及保水性的测定采用于巍［1］等的方法略作修改:先称离心管质量(m)，取盐溶蛋白提取液10 mL置于干净离心管中制备凝胶，在4℃下保存24 h，称离心管和凝胶质量m1，然后将凝胶在3 000 r/min、4℃下离心5 min，称倾去水分后的离心管和凝胶的质量m2，则:

盐溶蛋白乳化性的测定参考郭玲［4］的方法略作修改:取一定量的盐溶蛋白提取液调节蛋白质浓度为1%，将盐溶蛋白提取液与大豆油按体积比3∶1的比例混合，在10 000 r/min的转速下乳化1 min后立即倒入小烧杯中，在杯底取50 μL的乳化液加入到5 mL的0.1%SDS(十二烷基磺酸钠)中，充分摇匀后在波长500 nm处测定吸光度，重复4次。乳化活力指数(EAI)和乳化稳定指数(ESI)用如下公式计算:

式中:A0，后迅速被稀释的乳化液的吸光度;Φ，油相体积分数(V/V，φ=0.25);c，蛋白质量浓度，g/mL;A10，乳化液在静置10 min后的吸光度。

2 结果与分析

2.1 蛋白质含量标准曲线

由图1可知，双缩脲法测定盐溶蛋白含量的标准曲线为y=0.039x+0.008 1，其R2=0.999，具有较好的拟合度，可用于盐溶蛋白乳化性测定中蛋白浓度的调整。

图1 蛋白质含量标准曲线Fig.1 Protein content standard curve

2.2 盐浓度对盐溶蛋白得率的影响

由图2可知，其他因素固定不变条件下，提取液的盐溶蛋白得率随着盐浓度的提高而增加，说明盐浓度在0.2～0.7 mol/L内，较高的盐浓度能提高盐溶蛋白的浸出率;盐浓度在0.7 mol/L以上，提取液的蛋白浓度变化不大，尤其在0.5和0.6 mol/L浓度时，提取液蛋白得率基本不变，0.8 mol/L提取浓度时得率稍有下降，表明在盐浓度在0.7 mol/L时，基本上将可溶的盐溶蛋白提出。因此，盐浓度0.7 mol/L是最优的选择，后续试验采取盐浓度0.7 mol/L。

图2 盐浓度对盐溶蛋白得率的影响Fig.2 Effects of salt concentration on salt soluble proteinyield

2.3 固液比对盐溶蛋白得率的影响

由图3可知，提取液的盐溶蛋白得率随着固液比的增加而增加，从1∶3到1∶4之间增幅显著，而后增幅缓慢。在要求提取液的盐溶蛋白浓度和得率尽可能高的情况下，固液比1∶4为最优，后续试验采用盐浓度 0.7 mol/L，固液比1∶4。

图3 固液比对盐溶蛋白得率的影响Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on salt soluble protein yield

2.4 浸提时间对盐溶蛋白得率的影响

从图4可以看出，提取液中蛋白含量随着浸提时间的增加而增加，在25 h以前，随时间的延长蛋白含量增长幅度较大;25 h以后，随浸提时间的延长蛋白质含量增长幅度很小。这表明，浸提25 h左右，盐溶蛋白基本上都已溶出，如果时间过长，蛋白性质会发生变化，不利于后期试验，综合考虑25 h是最佳的浸提时间，后续试验采取盐浓度0.7 mol/L、固液比1∶4、提取时间为25 h。

图4 时间与盐溶蛋白得率的关系Fig.4 Effects of extraction time on salt soluble protein yield

2.5 浸提液pH值对盐溶蛋白得率的影响

从图5可以看出，随着pH值的改变，盐溶蛋白得率的变化幅度非常大，表明pH值的变化对盐溶蛋白的提取的影响很大。pH值从5.0到6.5，盐溶蛋白得率迅速升高，pH为6.5时盐溶蛋白得率最高，达到12%;pH 6.5以后，得率开始下降。这与 Westphalen［5］和 Lesiow［6］的研究结果类似。

图5 pH与盐溶蛋白得率的关系Fig.5 Effects of pH on salt soluble protein yield

2.6 盐溶蛋白提取工艺正交优化

由表2和表3可以看出，最后确定盐溶蛋白提取的最佳工艺条件为:A1B3C3D3，即提取液中NaCl浓度为0.8 mol/L、固液比为1∶5、提取液 pH 为6.0、浸提时间为30 h。在这4个因素中，影响大小顺序是B＞C＞D＞A，即盐浓度影响最大，其次是固液比和提取时间，pH值影响最小;浸提时间和pH值影响相对较小。最佳工艺参数组合A1B3C3D3出现在正交表中即实验3，在此最佳条件下鲢鱼背肉盐溶蛋白得率为12.66%，提取效果最好。优于刘安军［7］研究中鳕鱼盐溶蛋白的最佳提取率。因此，后续实验提取条件为NaCl浓度为0.8 mol/L、固液比 1∶5、提取液pH值为6.0、浸提时间为30 h。

表2 正交试验表Table 2 Results of the orthogonal test

表3 正交试验方差分析表Table 3 Variety analysis of the results

2.7 温度对白鲢盐溶蛋白热诱导凝胶保水性的影响

从图6可以看出，随着处理温度的升高，保水性升高，在 80℃ 时保水性达到最大值，最大值为98.24%，90℃ 时保水性逐渐下降。这可能是由于:一是温度升高后，水分子的运动加剧，加快了蛋白质的吸水速度;二是在热作用下，某些处于蛋白质分子内部的极性侧链转而朝向蛋白质表面，进而提高了蛋白质的亲水性［8］。从结果可知，以保水性为依据，80℃为白鲢盐溶蛋白最佳凝胶温度，即后续试验采用盐溶蛋白热凝胶温度为80℃。

图6 温度对盐溶蛋白凝胶保水性的影响Fig.6 Effects of temperature on salt soluble protein’s WHC

2.8 不同提取助剂对白鲢盐溶蛋白热诱导凝胶保水性的影响

由图7可知，空白对照组的盐溶蛋白热凝胶保水性最低，添加磷酸盐对盐溶蛋白热诱导凝胶的保水性均有提升作用，其中浓度0.1 mol/L的磷酸缓冲液［9］保水性最高，最高为96.61%，浓度为0.01 mol/L的三聚磷酸钠溶液［10］效果次之。这是由于肌肉蛋白在pH值约5.4的等电点时保水性最差，添加磷酸盐可将肉制品的pH值提高到6.0～6.4。磷酸盐改变蛋白质电荷电势使蛋白质之间互相排斥，从而产生更大的空间容纳更多水分，提高肉的保水性［2，11］。而磷酸缓冲液对凝胶保水性的提升效果优于三聚磷酸钠，可能是由于磷酸缓冲液的离子强度较高，更利于盐溶蛋白的溶解，因而凝胶保水性得以增强［12］。

图7 不同提取助剂对盐溶蛋白凝胶保水性的影响Fig.7 Effects of extraction agent on salt soluble protein’s WHC

2.9 白鲢盐溶蛋白的乳化活性及乳化稳定性

由表4可知，白鲢盐溶蛋白的 EAI为19.47 m2/g，ESI为 89.50%，优于董哲［13］文章中相同离子条件下草鱼盐溶蛋白的EAI和ESI。白鲢盐溶蛋白的EAI、ESI的标准差均较小，具有较好稳定性，偏差较小。由此可见，白鲢盐溶蛋白具有较好乳化能力，能够较好改善肉糜制品加工质量。

表4 盐溶蛋白的乳化活性及乳化稳定性Table 4 EAI and ESI of salt soluble protein

2.10 不同提取助剂对白鲢盐溶蛋白乳化活性与乳化稳定性的影响

由图8可知，空白对照组白鲢盐溶蛋白 EAI 最低，添加磷酸缓冲液及三聚磷酸钠对白鲢盐溶蛋白EAI均有较大提高，其中以三聚磷酸钠提升作用最大，最大为19.52 m2/g，磷酸缓冲液次之。这可能是由于磷酸盐提高了鱼肉蛋白质的离子强度，改变了鱼肉的pH值，影响了蛋白质分子疏水基团的分布情况，使得乳化活性提高。这与杨玉玲等［14］报道的 pH和离子强度是影响盐溶蛋白的极显著因素相符。

图8 不同提取助剂对盐溶蛋白的乳化活性(EAI)的影响Fig.8 Effects of extraction agent on salt soluble protein’s EAI

由图9可知，添加磷酸缓冲液对白鲢盐溶蛋白ESI有所改善，其稳定性最高，最高为97%，而三聚磷酸钠则使白鲢盐溶蛋白ESI降低。这可能是由于磷酸盐缓冲液对盐溶蛋白乳浊液体系的pH具有较高的稳定性，进而提高了乳化稳定性。综合比较磷酸缓冲液、三聚磷酸钠对白鲢盐溶蛋白EAI和ESI的影响，添加磷酸盐缓冲液能较好提升白鲢盐溶蛋白乳化能力。

图9 不同提取助剂对盐溶蛋白的乳化稳定性(ESI)的影响Fig.9 Effects of extraction agent on salt soluble protein’s ESI

3 结论

本研究优化了白鲢鱼肉盐溶蛋白的提取工艺参数，结果表明 NaCl浓度为0.8 mol/L、pH值为6.0、浸提时间为30 h、固液比为1∶5时，鲢鱼鱼背肉盐溶蛋白最大提取浓度为2.602 4 g/100 g。通过对白鲢盐溶蛋白的加工特性研究，发现其保水性可达98.24%，乳化活性最大为19.47 m2/g，乳化稳定性最大为89.45%，具有较好的凝胶保水性及乳化能力，可有效改善肉糜制品加工品质。

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