金针菇胞外多糖的化学结构及其抗氧化活性分析

沙日娜

(包头轻工职业技术学院，内蒙古包头，014035)

金针菇(Flammulina velutipes(Fr.)Singer)，又名金钱菌，属真菌门(Eumycophyta)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲 (Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricales)，口磨科(Tricholomataceae)，小火焰菌属(Flammulina)或金钱菌属(Collybia)。金针菇口味鲜美，营养丰富，富含多种生物活性物质，如多糖、维生素、蛋白质、多元酚、朴菇素、膳食纤维等。近年来的研究表明，金针菇提取物具有免疫调节［1-2］、降胆固醇［3］、抑制肿瘤生长［4-6］等多种生理功能，但是其功效关系尚不清楚，其中金针菇多糖被认为是重要的功能因子之一。本研究对金针菇胞外多糖通过DEAE-52纤维素柱和G-100葡聚糖进行分离纯化，分别研究了FEPS-1和FEPS-2的分子量、单糖组成、键型和抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

供试菌种:金针菇(Flammulina velutipes)，内蒙古农科院保存。

深层液体种子培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，VB10.1 g，水 1 L，pH自然。

液体种子培养条件:25℃恒温摇床160 r/min振荡培养10 d。

深层液体发酵培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，VB10.1 g，蛋白胨3 g，酵母粉 3 g，水 1 L，pH 自然。

深层液体发酵培养条件:100 L气升式液体深层发酵罐中培养14 d，发酵温度25℃，连续通入无菌空气。

30%H2O2，天津市凯通化学试剂有限公司;体积分数为95%的乙醇，天津市百世化工有限公司;DPPH，Sigma公司;DEAE-52纤维素，Sigma公司;葡聚糖G-100，Sigma公司;苯酚天津市天大化学试剂厂;浓H2SO4，淄博化学试剂厂有限公司;浓HCl，淄博化学试剂厂有限公司;三氯乙酸，天津大茂化学试剂厂。

752-N紫外可见分光光度计，上海精宏实验设备有限公司;GC2010气相色谱仪，日本津岛公司;TDL-5-A型台式离心机，上海安亭科学仪器厂;Nicolet380傅立叶变换红外光谱仪，美国热电集团;Nicolet380傅立叶变换红外光谱仪，美国热电集团;DK-S24型恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司;LXJ-68-02型离心机，北京医疗仪器修理厂;DZF-6021型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 多糖的提取

首先对发酵液进行浓缩，浓缩温度为75℃，然后利用醇沉法提取金针菇胞外多糖。

1.3 成分含量测定

总糖含量采用苯酚-硫酸法［7］测定。

1.4 多糖的凝胶柱层析

首先采用DEAE-纤维素离子交换柱对多糖进行分离纯化，用浓度梯度为0.2，0.5，1.0 mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱速度控制在1 mL/min，每个洗脱梯度收集25管，每管收集2 mL，利用苯酚-硫酸法测定收集到的多糖溶液浓度，绘制洗脱曲线。然后葡聚糖G-100凝胶柱对多糖进行进一步分离纯化和纯度鉴定［8］。用0.1 mol/L NaCl溶液充分平衡层析柱后，用蒸馏水作为洗脱剂，洗脱速度控制在0.1 mL/min，每管收集2 mL，同样利用硫酸-苯酚法对收集到的多糖溶液浓度测定，绘制洗脱曲线。

1.5 多糖的分子质量测定

采用高效凝胶渗透色谱法(HPLC)对多糖的分子质量进行测定［9］。用高效液相色谱仪(1260，Agilent Technologies，USA)，SHODEX SB-806HQ 色谱柱column(8.0 mm ×300 mm)及示差折光检测器测定。流动相为0.2 mol/L NaCl溶液，进样量为100 μL，流速为0.5 mL/min，柱温保持在5℃。标准品及样品质量浓度均为2 mg/mL。用葡聚糖系列样品作为标准品，以lgMw(分子质量对数)对ET(保留时间)绘制标准曲线，得线性回归方程:lgMw=1-0.342 9ET+11.975，R2=0.999 1。用 0.2 mol/L NaCl水溶液将样品配成质量浓度为2 mg/mL的溶液，上柱测定其保留时间，根据回归方程计算分子质量。

1.6 构成糖分析

糖样品经过酸加热完全水解(0.25 mol/L H2SO4，100 ℃，16 h)，或者不经过水解处理，按照Blakeney［10］等制备成各单糖的全乙酰化糖醇衍生物，然后进行气相色谱(GC)分析(岛津 GC-14C，柱温210℃，N2流速30 mL/min)，分离柱为岛津公司的毛细管柱DB-1(0.25 mm×30 m)。

1.7 多糖的红外光谱(IR)分析

多糖的 IR分析仪采用 Perkin Elmer公司的Spectrun GXFT-IR红外光谱分析系统。样品采用KBr压片法进行测定。

1.8 多糖的体外抗氧化分析

多糖对DPPH自由基的清除率测定反应体系如下:2 mL体积分数为95%的乙醇或DPPH(0.1 μmol/L)，2 mL不同质量浓度的多糖溶液(100～1 000 mg/L)。反应混合物在25℃水浴15 min，在517 nm处测定吸光度［11］。清除羟基自由基的测定方法是采用Smironff(1989)的方法［12］。多糖还原力的测定方法根据 Oyaizu(1986)的方法［13］。

2 结果与分析

2.1 金针菇多糖的组分分离纯化

采用DEAE-纤维素柱对FEPS进行组分分离，分别利用蒸馏水和 0.2，0.3，0.5，1.0 mol/L 的 NaCl溶液作为流动相对FEPS洗脱，得到2个组分，如图1所示。FEPS分离得到FEPS-1和FEPS-2两个组分。对经过DEAE-纤维素分离得到的2个组分用葡聚糖G-100凝胶做进一步分离，如图2所示。FEPS-1和FEPS-2均分离得到一个单一的洗脱峰，表明FEPS-1和FEPS-2均为纯多糖。对FEPS-1和FEPS-2进行紫外光谱扫描(ultravialet spectrum，UV)，试验结果显示FEPS-1和FEPS-2在280 nm处有特征吸收峰，表明两种组分可能是以糖蛋白的形式存在。

图1 FEPS的DEAE-纤维素离子交换柱层析洗脱曲线Fig.1 Elution curve of FEPS on DEAE-celluose collumn

图2 两种多糖组分的葡聚糖G-100凝胶层析洗脱曲线(A)FEPS-1和(B)FEPS-2Fig.2 The profile of G-100 gel filtration chromatography by two polysaccharides(A)FEPS-1 and(B)FEPS-2

2.2 化学结构分析

由图3通过计算得知，FEPS的重均分子质量(Mw)为3.64×104Da，数均分子质量(Mn)为1.56×104Da，黏均分子质量(Mv)为3.28 ×104Da，Z 均分子质量(Mz)为7.14×104Da，峰位分子质量(Mp)为1.16×104Da。FEPS的Mw/Mn值为2.33。

图3 FEPS高效液相色谱图分析Fig.3 HPLC spectra of FEPS

如图4所示FEPS-1的Mw为5.53×104Da，Mn为2.41×104Da，Mv为4.99×104Da，Mz为1.11×105Da，Mp为1.23×104Da。FEPS-1的Mw/Mn值为2.29。

图4 FEPS-1高效液相色谱图分析Fig.4 HPLC spectra of FEPS-1

由图5可知，FEPS-2的Mw为1.36×104Da，Mn为1.05×104Da，Mv为3.55×104Da，Mz为1.20×105Da，Mp为1.14×104Da。FEPS-2的Mw/Mn值为1.29。

图5 FEPS-2高效液相色谱图分析Fig.5 HPLC spectra of FEPS-2

根据标样的保留时间来测定单糖的含量，由表1可知，FEPS-1主要由鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖，其含量分别为28.51%，62.94%，2.08%和6.47%，对应的摩尔比为 15.7∶31.3∶1.1∶3.3，由此可以看出，FEPS-1含量最多的单糖是葡萄糖和鼠李糖。FEPS-2主要由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖组成，含量分别是68.23%，21.48%和10.29%，相应的摩尔比为37.5∶10.8∶5.2。可以看出 FEPS-2含量最多的单糖也是葡萄糖和鼠李糖。

表1 气相色谱结果Table 1 Results of gas chromatograph

如图6所示，胞外多糖的两个组分(FEPS-1和FEPS-2)的红外光谱分析，两个组分在3 600～3 200 cm-1附近有较强的羟基(—OH)伸缩振动吸收峰［14］。FEPS-1在1 650.74 cm-1处的吸收峰说明有氮氢键(N—H)的存在［15］。FEPS-1 和 FEPS-2 分别在865.69 cm-1和880.72 cm-1处的吸收峰，表明它们的多糖结构中存在呋喃环［16］。

2.3 两种组分的体外抗氧化活性

2.3.1 FEPS-1和FEPS-2对DPPH的清除作用

图7表明，FEPS-1和FEPS-2清除DPPH的能力是随多糖浓度的升高而增大，在浓度为100 μg/mL时，FEPS-2对DPPH的清除率为(73.67±1.65)%。据报道，当质量浓度为100 μg/mL时，香菇多糖对DPPH的清除率为15%，灵芝多糖对DPPH的清除率为15%［17］。FEPS-2的EC50为(53±0.02)μg/mL远远高于香菇多糖(400 μg/mL)［18］和灵芝多糖(1 000 μg/mL)［17］。结果表明，FEPS-2对DPPH具有较高的清除率。

图6 FEPS-1和FEPS-2的红外光谱图Fig.6 FT-IR spectra of FEPS-1和FEPS-2

图7 FEPS-1和FEPS-2对DPPH的清除作用Fig.7 Scavenging effects of FEPs-1 and FEPs-2 on DPPH radicals

2.3.2 FEPS-1和FEPS-2对羟基自由基的清除作用

FEPS-1和FEPS-2对羟基自由基的清除作用见图8。在100 μg/mL时 FEPS-1和 FEPS-2对羟基自由基的清除率分别为(12.51±1.02)%和(69.94±4.81)%，FEPS-2对羟基自由基的清除作用是灵芝多糖［17］的2.41 倍，香菇多糖［18］的2.59 倍，白灵菇多糖［21］的 1.77 倍。

图8 FEPS-1和FEPS-2对羟基自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effects of FEPs-1 and FEPs-2 on hydroxyl radicals

2.3.3 FEPS-1和FEPS-2的还原力测定

如图9所示，在100 μg/mL时，FEPS-1和FEPS-2在700 nm处测得的还原力分别为(0.23±0.04)和(0.41 ±0.02)，FEPS-2的还原力比香菇高0.06，比白灵菇、金针菇、美味牛肝菌分别高 0.36，0.24，0.23［22］。说明2种组分都具有非常强的还原力，FEPS-2的还原力更为显著。

图9 FEPS-1和FEPS-2还原力测定Fig.9 Scavenging effects of FEPS-1 and FEPS-2 on DPPH radicals

3 结论

在本试验中，经过DEAE-纤维素离子交换柱和葡聚糖G-100凝胶柱的分离，FEPS分离得到多糖组分分别为FEPS-1和FEPS-2。利用气相色谱法测定了FEPS-1和FEPS-2单糖的组成。FEPS-1主要由鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖，FEPS-2主要由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖组成。FEPS和FEPS-2中鼠李糖和葡萄糖含量都比较高。在结构分析中，通过红外光谱法对FEPS-1、GRPS-2在4 000～400 cm-1区段进行扫描，结果显示，两者均为含有呋喃环的多糖。

自由基是人体生命过程中生物化学反应产生的中间产物，体内自由基过多或清除缓慢均会引起分子、细胞甚至器官损伤，导致病变。结果表明，金针菇胞外多糖组分具有直接清除羟基自由基和DPPH的能力，且清除能力与多糖的浓度呈正相关，随多糖浓度的提高，FEPS-2清除率可达到70%以上。此外两者均有较强的还原力。

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