VEGF-C和CCBE1在子宫内膜异位症组织中的表达与意义

杨永康，张淼芳，李 峰，席稳燕(陕西中医药大学第二附属医院妇产科，咸阳 7000;西安交通大学第一附属医院泌尿外科;西安交通大学第二附属医院妇产科;通讯作者，E-mail:xveyyk004@6．com)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)的发病率近年来随着剖宫产率、人工流产与宫腹腔镜操作的增多逐年增高，且与社会经济状况呈正相关［1］。子宫内膜异位症具有多样性表现，在组织学上呈现良性表现，但却有增生、侵袭、转移及复发等类似恶性肿瘤的特征。目前在临床上对于子宫内膜异位症的治疗效果并不理想，主要原因是其发病机制目前还不是很清楚，所以只能是对症治疗，而不能做到对因治疗［2，3］。

随着研究的深入，学者对于子宫内膜异位症的发病机制提出了很多的假说，其中异位种植学说目前被众多学者所接受。异位种植假说认为子宫内膜异位症患者体内具有黏附、侵袭及血管新生等生物学功能的子宫内膜是异位种植的根本。近年来研究发现，血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)与胶原和钙结合EGF域1(collagen and calcium binding EGF domains 1，CCBE1)的结合有诱导淋巴管的生成和促进肿瘤细胞淋巴转移的作用［4，5］，其在子宫内膜异位症组织中的表达如何，是否也参与了子宫内膜异位症的病理生理过程，目前研究还很少。

1 材料与方法

1．1 研究对象

选取2013－03～2013－11在西安交通大学第二附属医院妇科腹腔镜中心行手术、病理检查确诊的子宫内膜异位症(卵巢型)的患者共36例;取同一患者的在位内膜和异位内膜，并将其分为在位内膜组和异位内膜组。在位内膜组增殖期20例，分泌期16例;异位内膜组增殖期33例，分泌期3例。对照组为同期因子宫肌瘤行手术、病理检查确诊为非子宫内膜异位症的患者共40例，取其新鲜内膜组织，增殖期22例，分泌期18例。所有研究对象术前3月内无激素使用史。

1．2 实验主要试剂和仪器

兔抗人CCBE1、VEGF-C单克隆抗体及HRP标记的羊抗兔二抗均购自北京博奥森生物技术有限公司。RNA提取试剂盒购自上海飞捷，cDNA反转试剂盒购自TAKARA公司。Trizol、氯仿、75%乙醇等均购于西安交通大学试剂科。OLYMPUS倒置显微镜、Bio-Teck多功能酶标仪、水浴锅、Bio-Rad CF96 QPCR系统、Bio-Rad PCR仪、电热恒温干燥箱、普通离心机、水平离心机、离心管、吸管、加样枪及其枪头、微量振荡器均由西安交通大学医学部中心实验室提供。CCBE1、VEGF-C及β-actin引物均购自苏州金唯智公司。

1．3 方法

1．3．1 免疫组化 将术中取得的子宫内膜及卵巢型子宫内膜异位囊肿壁浸泡于10%中性甲醛，常规固定、脱水、石蜡包埋及切片处理。在实验前，在镜下观察组织形态进行筛查。采用免疫组化两步法:常规脱蜡、水化组织切片，3%H2O2室温下孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶活性;抗原行热修复处理后加入适当稀释的一抗，4℃过夜;滴加HRP标记的羊抗兔二抗，37℃孵育20 min;DAB(二氨基联苯胺)显色，苏木素复染、盐酸分化、氨水返蓝后封片。同时设空白对照，滴加PBS替代一抗。显微镜下观察并拍照，Image pro软件对免疫组化各标本图像进行光密度检测。

1．3．2 组织mRNA提取 正常内膜组织、在位内膜组织和异位内膜组织各10例，前两者中增殖期和分泌期各5例。将组织剪成小块在液氮中磨成粉末后加入盛有Trizol液的EP管中，室温放置5 min。加入200 μl氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15 s。12 000 r/min离心10 min，取上层于一新的EP管中，加入500 μl异丙醇，混匀。室温放置 10 min，12 000 r/min离心10 min。弃上清液，加入1 ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12 000 r/min离心5 min。重复操作一次，弃去上清液，室温干燥5－10 min。用30 μl DEPC处理过的水将RNA溶解，分光光度计定量。

1．3．3 反转录及 PCR 反转20 μl体系:200 μl EP中加入4 μl 5X TAKARA反转 MIX，加入1 000 ng RNA，无酶水将体系补充至20 μl。Bio-Rad PCR 仪反转录成 cDNA。25 μl PCR 体系:12．5 μl SYBGREEN，8．5 μl双蒸水，上下游引物各1 μl，2 μl cDNA。于RT-PCR仪中40个循环。以β-actin作为内部对照。

表1 引物列表Table 1 The primers used in RT-PCR

1．4 统计学分析

使用Graphpad prism5及 photoshop7．0对实验数据进行整理并作图。SPSS19．0统计软件对各组数据进行One-way ANOVA检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 VEGF-C与CCBE1在各内膜组织中的表达及分布情况

免疫组化染色显示，VEGF-C和CCBE1在各内膜组织的间质细胞与腺上皮细胞中均有表达，且主要定位于细胞质(见图1，2)。

图1 VEGF-C在各组内膜组织的表达Figure 1 The expression and distribution of VEGF-C in different endometria

图2 CCBE1在各组内膜组织的表达Figure 2 The expression and distribution of CCBE1 in different endometria

2．2 VEGF-C在各组织中的表达

免疫组化和RT-PCR结果均显示，异位内膜组和在位内膜组各期中VEGF-C的表达均明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0．05);在位内膜组与异位内膜组进行比较，差异没有统计学意义(P＞0．05，见图3A和B)。在位内膜组增殖期和分泌期VEGF-C的表达差异无统计学意义(P＞0．05)。对照组增殖期和分泌期VEGF-C的表达差异也无统计学意义(P ＞0．05，见图3C 和 D)。

2．3 CCBE1在各组织中的表达

免疫组化和RT-PCR结果均显示，异位内膜组中CCBE1的表达明显高于对照组(P＜0．05)，但低于在位内膜组，差异有统计学意义(P＜0．05);在位内膜组中CCBE1表达高于对照组，差异有统计学意义(P＜0．05，见图4A和B)。在位内膜组CCBE1的表达增殖期高于分泌期，差异有统计学意义(P＜0．05);而对照组增殖期和分泌期CCBE1的表达比较，差异无统计学意义(P＞0．05，见图4C和D)。

3 讨论

国内外学者研究发现，在子宫内膜异位症中VEGF-C可以促进异位内膜病灶的形成、生长、侵袭和转移，这一过程中的具体机制认为有两个方面:促进血管新生［6］和促进淋巴管的生成［7］。CCBE1 作为淋巴管生长因子，虽然研究历史不长，但备受关注。在动物实验和人体组织实验中发现，其对于淋巴管的形成有着重要的促进作用。CCBE1的突变或者缺失可以导致淋巴管的发育异常或者淋巴水肿的等现象［8，9］。

本研究通过免疫组化及RT-PCR方法检测子宫内膜异位症在位、异位内膜及正常子宫内膜中VEGFC和CCBE1的表达，并初步探讨其在子宫内膜异位症的病因—淋巴转移学说中的意义。结果发现:VEGF-C在异位内膜组和在位内膜组中的表达均高于对照组(正常子宫内膜)，差异有统计学意义(P＜0．05)，前两者之间无差异;这与国外学者Takehara等［10］的研究存在差异，他们研究发现在位内膜的VEGF-C表达较对照组下调，在增殖期和分泌期中VEGF-C的表达差异无统计学意义(P＞0．05)。CCBE1在异位内膜组的表达高于对照组，但低于在位内膜组，差异有统计学意义(P＜0．05)。研究结果提示CCBE1和VEGF-C在子宫内膜异位症的在位和异位内膜组织中表达均高于对照组，结合二者的生物学特性，其可能参与了子宫内膜异位症的病理生理过程。

图3 VEGF-C在各组内膜组织中的表达Figure 3 The expression of VEGF-C in different endometria

图4 CCBE1在各组内膜组织中的表达Figure 4 The expression of CCBE1 in different endometria

Bos等通过对CCBE1基因缺失的大鼠模型观察发现，CCBE1其自身对淋巴管生成的作用不大，但能够显著增强VEGF-C的表达，进而促进淋巴管生成，并且其作用机制与VEGFR-3磷酸化状态修饰无关［11］。结合Bos等的研究结果，我们认为淋巴管生成因子CCBE1和VEGF-C除了本身具备的促进淋巴管生成作用，参与子宫内膜异位症的发生发展的病理生理机制外，CCBE1还可以使VEGF-C的促淋巴管生成的作用明显增强，发挥更大的效应。在位内膜的表达高于异位内膜，这也与郎景和等提出的“在位内膜决定论”相符合，间接印证了在位内膜的分子生物学、遗传学、组织病理学等的特殊性质，将对逆流至子宫腔以外的内膜形成子宫内膜异位症起决定作用［12，13］。在位内膜组中增殖期的 CCBE1的表达高于分泌期，差异具有统计学意义，提示子宫内膜异位症CCBE1的表达可能与卵巢激素的分泌有关，呈激素依赖性。异位内膜组织随着卵巢周期的变化而发生增殖期和分泌期的改变，但其并不与在位内膜的改变同步，多表现为增殖期改变，且分泌期标本过少，所以本研究未进行对比。

有研究表明，CCBE1和VEGF-C的结合有诱导淋巴管的生成和促进肿瘤细胞淋巴转移的作用［5］。动物实验也表明，CCBE1的突变或者缺失可以导致淋巴管的发育异常或者淋巴水肿的等现象，且能够显著增强 VEGF-C的表达，进而促进淋巴管生成［9，10］。本实验通过对 CCBE1 和 VEGF-C 在子宫内膜异位症组织中的表达检测，从淋巴转移学说进一步探索子宫内膜异位症的病理生理过程。随着医学科技的发展及人们对子宫内膜异位症认识的不断深入，抑制淋巴管的新生和淋巴转移可能成为子宫内膜异位症临床治疗的新方向。

［1］狄文．子宫内膜异位症与子宫腺肌病［M］//谢幸，苟文丽．妇产科学．8版，北京:人民卫生出版社，2013:P268－269．

［2］Kvaskoff M，Mu F，Terry KL，et al．Endometriosis:a high-risk population for major chronic diseases［J］．Hum Reprod Update，2015．21(4):500－516．

［3］Mavrelos D，Saridogan E．Treatment of endometriosis in women desiring fertility［J］．J Obstet Gynaecol India，2015，65(1):11－16．

［4］Goralczyk B，Smolarz B，Romanowicz H，et al．Single nucleotide polymorphisms of VEGF gene in endometriosis［J］．Pol Merkur Lekarski，2012，32(189):151－153．

［5］李文媛，刘艳翠，尹国华，等．喉癌中胶原和钙结合EGF域1的表达与VEGF-C和淋巴管生成及预后的关系［J］．基础医学与临床，2013，33(9):1160－1164．

［6］郎景和．关于子宫内膜异位症的再认识及其意义［J］．中国工程科学，2009，11(10):137－142．

［7］蒋红清，李亚里，陈浩，等．血管内皮生长因子C和受体3在子宫内膜异位症的表达及意义［J］．军医进修学院学报，2007，28(2):99－101．

［8］Alders M，Mendola A，Ades L，et al．Evaluation of clinical manifestations in patients with severe lymphedema with and without CCBE1 mutations［J］．Mol Syndromol，2013，4(3):107－113．

［9］Hogan BM，Bos FL，Bussmann J，et al．CCBE1 is required for embryonic lymphangiogenesis and venous sprouting［J］．Nat Genet，2009，41(4):396－398．

［10］Takehara M，Ueda M，Yamashita Y，et al．Vascular endothelial growth factor A and C gene expression in endometriosis［J］．Hum Pathol，2004，35(11):1369－1375．

［11］Bos F L，Caunt M，Peterson-Maduro J，et al．CCBE1 is essential for mammalian lymphatic vascular development and enhances the lymphangiogenic effect of vascular endothelial growth factor-C in vivo［J］．Circ Res，2011，109(5):486－491．

［12］张珂铭，王欢．子宫内膜异位症致病机制研究进展［J］．重庆医学，2011，40(2):192－194．

［13］仝佳丽．子宫内膜异位症的在位内膜病变研究进展［J］．现代妇产科进展，2010，19(6):465－467．