结肠癌患者血浆中microRNA-100的检测及其与临床病理特征的关系

张 铭，李晓利，许君望，黄 蓉，吉亚红，张娜娜，李 娜(西安交通大学医学院附属红会医院消化内科，西安 70054;西安交通大学第一附属医院消化内科;通讯作者，E-mail:zhangminghonghui@6．com)

结肠癌(colon cancer)是常见的胃肠道恶性肿瘤，早期表现为腹胀、消化不良，而后出现排便习惯改变，便前腹痛，稍后出现黏液便或黏液脓性血便。结肠癌的发病原因尚未清楚，遗传因素和环境因素均发挥了一定作用，流行病学和动物实验研究提示结肠癌的发病与高脂肪食谱和食物纤维摄入不足密切相关［1］。微小 RNA(microRNA，miRNA，miR)是一类广泛存在于真核生物中长度约为18－25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，miRNA通过与靶基因mRNA的3'端非编码区域(3'-untranslated region，3'-UTR)结合从而抑制靶基因的表达，研究证实miRNA在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用［2］。由于miRNA长度较短且能较强地抵抗RNA酶的降解，miRNA可以与蛋白质结合并在血液中稳定存在［3］。miR-100是属于miR-99家族成员之一，越来越多研究证实miR-100在多种肿瘤中表达异常，在不同类型的肿瘤中，miR-100可以发挥致癌基因作用或抑癌基因作用［4－12］。有学者研究发现在结直肠癌组织或细胞株中miR-100表达下调，且与肿瘤的进展及预后有关［13，14］。为了进一步研究miR-100在结肠癌中的作用，本研究采用茎环RT-PCR法检测结肠癌患者血浆中miR-100的表达水平，分析miR-100表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴转移、远处转移及临床分期等病理参数之间的关系，以便为研究结肠癌的发病机制、早期诊断、判断预后及治疗提供实验数据。

1 材料与方法

1．1 研究对象

本研究选取2014－01～2014－09在我院消化内科及普外科住院确诊的结肠癌患者40例，其中男性26例，女性14例，年龄44－78岁，平均年龄(62．97±17．13)岁，均经过术后病理结果证实。根据美国癌症联合委员会(AJCC)/国际抗癌联盟(UICC)结直肠癌TNM分期系统(2010年第七版)进行TNM分期。40例同期健康体检者作为正常对照组，其中男性25例，女性15例，年龄44－73岁，平均年龄(59．14±14．75)岁。本研究获得医院伦理委员会的批准。

1．2 方法

1．2．1 主要试剂与仪器 RNA提取试剂 mirVanaTMmiRNA分离试剂盒为美国Ambion公司产品，miScript Reverse Transcription试剂盒为美国Ambion公司产品，SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ为德国Qiagen公司产品，紫外分光光度计购自美国Thermo Scientific公司，冷冻高速离心机购自德国Eppendorf公司，定量PCR扩增仪购自美国Bio-Rad公司。

1．2．2 方法 所有病例均在进行手术、放疗或化疗等抗肿瘤治疗前进行采样，无菌抽取静脉血5．0 ml，置于EDTA抗凝管中，室温下2 500 r/min离心10 min后收集上层血浆置于无RNA酶的EP管中，4℃12 000 r/min再次离心10 min后收集上清至新的无RNA酶的EP管，－80℃保存待用。采用mir-VanaTMmiRNA分离试剂盒提取血浆总RNA，操作严格按照说明书进行。使用紫外分光光度仪检测RNA浓度及纯度，计算 OD260/OD280比值(比值在1．8－2．1的 RNA 符合要求)，－80 ℃保存。根据文献［15］合成miR-100及内参照U6茎环RT引物及PCR引物，miR-100 RT引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAGT，PCR上游引物:GCTCTGAACCCGTAGARCCGAAC，下游引物:GTGCAGGGTCCGAGGT;U6 RT引物:AACGXTTCACGAATTTGCGT，PCR上游引物:CTCGCTTCGGCAGCACA，下 游 引 物:AACGXTTCACGAATTTGCGT。使用 miScript Reverse Transcription试剂盒进行逆转录反应，20 μl反应体系包括:2．0 μl茎环逆转录引物、10．0 μl逆转录缓冲液(2 ×)、3．0 μl总 RNA、1．0 μl逆转录酶及4．0 μl水，反应条件为:37℃ 60 min，95℃ 5 min，合成的cDNA在－20℃保存。采用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ进行定量 PCR 扩增，20 μl PCR 扩增体系包括:10 μl SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)、上下游引物各 1．0 μl、4．0 μl cDNA 模板、4．0 μl 水;扩增程序为:95 ℃预变性3 min，95℃ 5 s、61℃ 30 s共35个循环，每个样本做三个复孔。扩增结束后得到循环阈值(Ct值)，miR-100 的表达水平采用 2－ΔΔCt进行分析，ΔΔCt=实验组ΔCt(目的基因Ct－内参基因Ct)－对照组ΔCt(目的基因Ct－内参基因Ct)。

1．3 统计学方法

采用SPSS 16．0软件进行数据统计学处理，计量资料采用±s表示，计数资料比较采用χ2检验，miR-100水平在不同临床病理参数之间的比较采用独立样本t检验。P＜0．05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 结肠癌患者与正常对照组血浆中miR-100水平的比较

茎环定量RT-PCR扩增结果显示，与正常对照组血浆中 miR-100水平(0．65±0．21)相比，结肠癌患者血浆中miR-100水平(0．39±0．14)明显降低，二者差异具有统计学意义(t=6．515，P ＜0．01)。

2．2 结肠癌患者血浆中miR-100水平与临床病理参数的关系

为了进一步研究miR-100在结肠癌发病中的作用，我们统计分析了结肠癌患者血浆中miR-100水平与临床病理参数的关系，结果发现，结肠癌患者血浆中miR-100水平在不同性别、年龄及不同肿瘤大小间差异无统计学意义(P＞0．05)，而有淋巴转移及远处转移的结肠癌患者血浆中miR-100水平明显低于无淋巴转移及远处转移的患者，二者差异均具有统计学意义(P＜0．05)，Ⅲ、Ⅳ期结肠癌患者血浆中miR-100水平明显低于Ⅰ、Ⅱ期患者，二者差异具有统计学意义(P＜0．05，见表1)。

表1 结肠癌患者血浆中miR-100水平与临床病理参数的关系Table 1 The relationships between the plasma levels of miR-100 and clinicopathological characteristics in patients with colon cancer

3 讨论

miRNA是存在于真核细胞当中具有进化保守性的一族非编码小片段 RNA，长度约为300－1 000的pri-miRNA经过一次加工后，成为长度大约为70－90个碱基的pre-miRNA，pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约18－25个核苷酸的成熟miRNA，miRNA在多种生理和病理过程均发挥重要的调控作用，大量研究证实多种miRNA在肿瘤中表达异常，与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等过程密切相关。miR-100是由Mourelatos等2002年发现的一种miRNA［16］，人 miR-100 基因定位于 11q24．1，大小为22个核苷酸，基因序列为 AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG。越来越多研究证实，miR-100在不同类型的肿瘤可能发挥不同的作用，miR-100可以发挥抑癌基因作用，也可以发挥促癌基因的作用［4－14］。研究发现宫颈癌、膀胱癌、肺癌、急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤组织或肿瘤细胞株中miR-100 低表达［4－9］，抑制肿瘤发生发展，而在前列腺癌、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)、胃癌中 miR-100 表达水平增高［10－12］，可以促进肿瘤的生长。

结肠癌是消化系统最为常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率及死亡率呈逐年升高的趋势。尽管手术、化疗及放疗等技术不断进步，但结肠癌患者5年生存率没有明显改善。利用miRNA芯片或定量PCR方法筛选miRNA在结肠癌组织和癌旁组织表达差异，结果发现100多种miRNA在结肠癌肿瘤组织、细胞株和正常组织中表达异常［17，18］，同时研究还发现 miR-20、miR-21、miR-31、miR-144、miR-155表达水平与肿瘤浸润、肿瘤分期、远处转移等临床病理特征有关［19－21］。国内外学者研究发现miR-17-3p和miR-92在结肠癌患者血浆中水平升高，肿瘤切除后水平明显下降［22，23］。目前国内外有关 miR-100与结肠癌关系的研究较少，国内学者利用MiRNAMap-2．0发现miR-100在结直肠癌中低表达，并利用定量PCR验证了这一结果，体外实验发现miR-100不仅可以调节结直肠癌细胞株SW620的生长和凋亡，而且可以抑制SW620细胞的侵袭，进一步的实验证实RAP1B是miR-100的靶基因［13］。Chen等［14］研究也发现与癌旁组织相比，结直肠癌组织中miR-100水平明显降低，且miR-100表达水平与肿瘤大小、淋巴转移、TNM分期及预后密切相关。由于miRNA可以稳定存在于血液中，血液样本便于取得，检测肿瘤患者血液中miRNA的水平成为研究的热点之一，国内学者研究发现卵巢癌患者血清中miR-100水平明显降低［24］。为了进一步研究miR-100在结肠癌中的作用，我们利用茎环RT-PCR方法检测了结肠癌患者血浆中miR-100的水平，结果发现结肠癌患者血浆中miR-100水平明显低于正常对照组(P＜0．01)，这与miR-100在结肠癌组织中的研究结果基本一致［13，14］。我们的研究还发现结肠癌患者血浆中miR-100水平在不同性别、年龄及肿瘤大小之间差异无统计学意义(P＞0．05)，而有淋巴转移及远处转移的结肠癌患者血浆中miR-100水平明显低于无淋巴转移及远处转移的患者，二者差异均具有统计学意义(P＜0．05)，Ⅲ、Ⅳ期结肠癌患者血浆中miR-100水平明显低于Ⅰ、Ⅱ期患者，二者差异具有统计学意义(P＜0．05)，这与Chen等在结肠癌组织中的研究结果一致［13］，但我们的研究却没有发现miR-100水平高低与肿瘤大小相关，这可能与病例的选择等因素有关。同时我们的研究病例数量偏少且缺乏随访，有待于扩大样本量进一步研究。

综上所述，miR-100在结肠癌患者血浆中水平降低，且与肿瘤的淋巴转移、远处转移及临床分期明显相关，综合国内外的研究结果提示miR-100参与了结肠癌发生发展过程。但miR-100在结肠癌中的具体作用及调控机制尚不清楚，相信随着研究的深入，miR-100可能为结肠癌的早期诊断和治疗提供新的策略。

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