PAK 6基因沉默对前列腺癌细胞放疗敏感性研究

王新敏 ，章乐 ，赵静 ，李强 ，倪钊 ，李应龙 ，钱彪 ，王勤章

（1石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科，石河子 832002；2石河子大学医学院病理生理教研室，石河子 832002；3石河子大学医学院第一附属医院放疗科，石河子 832002）

前列腺癌（Prostate Cancer，PCa）为老年病，传统的手术、放疗、化疗和激素疗法对激素难治性前列腺癌治疗效果不佳，国内外许多学者都在探求其在基因水平的调控方法和寻找治疗的新靶点。p21活化激酶6(p21-activated kinase 6，PAK6)是一种最近被证实而且很少被了解的p21激活的磷酸化蛋白激酶家族成员之一[1]。在前期的研究中我们发现前列腺癌组织中，PAK6的蛋白表达和mRNA的表达均呈阳性，并远远高于前列腺增生组织，和前列腺癌的分化程度密切相关[2-3]。提示临床上若要全面阻断雄激素作用，除要阻断雄激素受体的信号外，还需抑制其旁路蛋白的激酶活性。本研究使用本课题组前期筛选并保存的靶向PAK6的shRNA，利用RNA干扰技术沉默PAK6基因的表达，研究PAK6沉默后对前列腺癌细胞放疗敏感性的影响，探讨能否通过干预PAK6增加前列腺癌细胞的放疗敏感性，为前列腺癌分子治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

前列腺癌细胞株LNCaP由本室保存，1640培养液、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司。携带GFP绿色荧光的PAK6-shRNA质粒和shNC对照质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，前期筛选出并由本实验室保存。PAK6多克隆抗体购自Santa Cruz公司；β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。ECL化学发光试剂盒购自美国Millipore公司。LipofectamineTM2000、购自美国Invitrogen公司。CCK-8购自DOJINDO公司。

1.2 方法

1.2.1 LNCaP细胞的培养 LNCaP细胞在含10%FBS胎牛血清的1640培养基中培养，培养条件为37℃、5%CO2饱和湿度。

1.2.2 PAK6-shRNA、shNC转染 LNCaP细 胞转染前24 h取对数生长期的LNCaP细胞，胰酶消化，用含10%FBS胎牛血清1640培养液（不含抗生素）重悬，细胞调整密度为2×105/L接种于六孔板中，每孔2 mL，待细胞融合度达到85%转染为宜。转染时以250μL OPTI-MEM培养基稀释10μL LipofectamineTM2000，再以250μLOPTI-MEM培养基稀释4μg质粒DNA，指腹轻弹混匀。室温放置5min后将两者混合，室温孵育20 min。吸去培养板中的无血清DMEM培养基，然后将500μL shRNALipofectamineTM2000混合液逐滴加入到培养板中，轻混至于37℃ 5%CO2培养。4～6 h后更换培养基继续培养备用。

1.2.3 实验分组 实验分为LNCaP组（空白对照组）；LNCaP+shNC组（空质粒对照组）；LNCaP+shRNA组（基因沉默组）。各组转染24 h后进行PAK6蛋白表达情况测定；并接受0、1、3、5 Gy单次剂量放射治疗，48 h后进行增殖和凋亡检测。

1.2.4 Western Blot分析PAK6蛋白表达情况用核算蛋白测定仪进行蛋白浓度测定、配平。进行SDS-PAGE（12%分离胶、5%浓缩胶）。用 Biorad的半干电转仪将蛋白转移到PVDF膜上，电压23V，40 min。室温封闭 2 h，分别加入一抗(PAK6和 β-actin抗体)、二抗，用 Millipore公司化学发光试剂盒显影并压片曝光。用凝胶成像仪分析系统Image Lab软件对Western blot检测条带进行灰度值扫描。计算目的蛋白与β-actin灰度值比值和统计学分析。

1.2.5 CCK-8法检测细胞的增殖情况 将转染24 h后的各组细胞接种于96孔板继续培养，每组设置3个复孔，单次放疗48 h后取出相应的孔板，加入 CCK-8试剂，继续培养4 h后测定450 nm波长处的吸光度值（A值）。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞的凋亡情况 用冷PBS对细胞洗涤2遍，制备单细胞悬液，再用冷PBS洗剂细胞2次；用冷的、制备好的1×binding buffer重悬细胞，调整细胞浓度为 1×106/mL，将不同的处理组各吸取100μL的细胞悬液到干净流式EP管中。每个管都加入5μL的Annexin V-APC和10μL的7-AAD，轻轻混合，置于4℃冰箱避光 15 min，再增加 380μL的 1×binding buffer置每个EP管，通过流式细胞仪对各组细胞进行检测。

1.3 统计学分析

利用SPSS16.0软件处理数据，实验所得数据资料进行单因素方差分析(ANOVA)比较各组间差异，P＜0.05表示有统计学显著性差异。

2 结果

2.1 转染24h后PAK6蛋白表达情况

转染24 h后PAK6蛋白表达情况见图1。

图1 Western Blot检测PAK6的表达Fig.1 PAK6 expression in different groups by Western Blot

各组细胞在转染24 h后β-actin蛋白条带亮度相似，但PAK6条带亮度有明显差异(图1a)。shRNA质粒转染组的PAK6蛋白条带亮度明显低于LNCaP组和LNCaP+shNC组。LNCaP组和LNCaP+shNC组在24 h无显著性差异（P＞0.05）。但LNCaP+shRNA与LNCaP组、LNCaP+shNC组相比均存在显著性差异(P＜0.05)。表明实验室保存的靶向PAK6-shRNA质粒可明显下调LNCaP细胞PAK6蛋白表达水平（图1b)。

2.2 LNCaP细胞的增殖情况

LNCaP细胞的增殖情况见表1，图2。各组细胞在转染 24 h后进行了 0、1、3、5 Gy单次剂量放射治疗与对照组相比，shRNA干扰组细胞对放疗的敏感性明显高于LNCaP组和LNCaP+shNC组，细胞增殖明显受到抑制，并且随着剂量的增加，基因沉默组的增殖抑制越明显(P＜0.05)。

注：与 LNCaP+shNC和 LNCaP组比较，*表示 P＜0.05，与 0Gy组比较，#表示 P＜0.05。

图2 LNCaP细胞的增殖情况Fig.2 The proliferation of LNCaP cells

2.3 LNCaP细胞的凋亡情况

LNCaP细胞的凋亡情况见（表 2，图 3）。通过检测各处理组的凋亡率发现，各组的凋亡率在放射剂量增加时均有显著提高(P＜0.05)，而 shRNA干扰组的细胞在放射剂量为 0、1、3、5 Gy时均高于LNCaP组和LNCaP+shNC组，并且在放射剂量为5 Gy时明显高于 0 Gy剂量组(P＜0.05)；而 LNCaP组和LNCaP+shNC组在放射剂量相同时均无明显差别。

注：与 LNCaP+shNC和 LNCaP组比较，*表示 P＜0.05，与0Gy组比较，#表示 P＜0.05。

图3 LNCaP细胞的凋亡情况Fig.3 The apoptosis rate of LNCaP cell with the action of PAK6 shRNA assayed with flow cytometry

3 讨论

前列腺癌是欧美国家最常见的肿瘤，随着人类平均寿命的延长和诊断技术的提高，前列腺癌在世界癌症总发病数中占十分之一，全球范围内每年约有20万患者死于前列腺癌。在美国，前列腺癌已经跃居第2位致死癌，约半数年龄大于50岁男性前列腺中可发现癌细胞。我国进入了老龄社会，并且人民生活水平有了显著提高，脂肪性食物摄入过多，前列腺癌的发病率有明显增加的趋势；新疆少数民族居多，饮食结构较为单一，以肉食为主，所以此类疾病在新疆是极为重要的一种肿瘤性疾病。

大多数前列腺癌患者早期无明显临床症状，所以一旦发现并被确诊时往往常常已属晚期，失去根治性手术时机；且在采用以雄激素全阻断为主的内分泌治疗方式一段时期后，常常转为雄激素非依赖性前列腺癌 (androgen independent prostate Cancer，AlPC)或抵抗性前列腺癌，对常规内分泌治疗不再有效，甚至出现复发或多发转移[4]。而传统的手术、放疗、化疗和激素疗法对这种激素难治性前列腺癌(hormone-refraetory prostat cancer，HRPC)治疗效果不佳，所以国内外许多学者都在探求对前列腺癌基因水平的调控方法和寻找治疗新靶点，还有一些研究尝试联合化疗和基因治疗结合的方式，以期在前列腺癌的治疗上取得突破。

现有研究表明，雄激素在前列腺（癌）的生长、转移与分化中起决定性作用[5]。雄激素主要是通过雄激素受体（androgen receptor，AR）在前列腺细胞中传递信号[4]，同时受到雄激素受体关联蛋白（ARAP）等旁路信号的调节。而新发现的p21活化激酶6(p21-activated kinase 6，PAK6)可与AR的配体结合域（LBD）上的氨基酸序列629-919结合，它也是通过酵母双杂交识别出来的新ARAP。PAK6能结合到AR代表着唯一所知的PAK家族成员和雄激素受体之间的相互作用[6]。在前期的研究中我们发现前列腺癌组织中，PAK6的蛋白表达和mRNA的表达均呈阳性，并远远高于前列腺增生组织，和前列腺癌的分化程度密切相关[2-3]。所以PAK6可能参与了前列腺癌与激素相关的肿瘤的生物学行为，因此临床上若要全面阻断雄激素作用，除要阻断雄激素受体的信号外，还需抑制其旁路蛋白的激酶活性。本研究利用前期筛选出的靶向PAK6的shRNA，从细胞水平研究阻断PAK6表达在前列腺癌放疗中的作用，探讨其可否作为前列腺癌分子治疗的靶点。

本研究用实验室前期筛选出的靶向PAK6的shRNA作用于激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP，并以空质粒shNC作为对照，检测在放疗剂量为0、1、3、5 Gy的条件下，LNCaP对放疗的敏感性是否有所增加。结果发现，各组的凋亡率在放射治疗时均有增加，细胞增殖也明显受到抑制；并且 shRNA干扰组的LNCaP细胞在放射剂量为0、1、3、5 Gy时凋亡率均高于LNCaP组和LNCaP+shNC组，并且在放射剂量为5 GY时明显高于0 GY剂量组 (P＜0.05)；其增殖情况则相反，并且随着放射剂量的增加这种趋势愈加明显。而LNCaP组和LNCaP+shNC组在放射剂量相同时凋亡率和增殖情况均无明显差别。这说明，当我们使用靶向PAK6的shRNA干扰PAK6的基因及蛋白表达时，可能增加LNCaP细胞对放射治疗的敏感性，导致杀伤更多的前列腺癌细胞，增加了其凋亡率及抑制了该细胞的增殖。这可能与PAK6参与AR的信号传导途径有关。因为有研究表明，在多种肿瘤的靶向治疗中，P21活化蛋白激酶家族显示出很好的开发潜能[7-9]，有多种肿瘤细胞可以通过抑制激酶蛋白的表达而改变癌细胞对化疗药物的敏感性[10-12]。而ARAP信号通路传导当中 ，PAK6活 化 与 MKK6 (MAP kinase kinase6)/P38MAPK信号通路密切相关[8]。本实验产生的结果是否与这一通路有关，我们将做进一步的研究。因此，通过基因沉默的方式干扰PAK6的表达或者干扰其信号通路，有可能对前列腺癌生长调控和干预治疗提供一定的帮助，作为临床上治疗前列腺癌的一个有力参考。

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