含胺功能化碳纳米管的壳聚糖/β-甘油磷酸钠水凝胶膜的制备及性能评价

李佳，苏珊珊，张雅，方贺，陈文

（石河子大学药学院，石河子 832002）

近年来，随着基因工程的发展，蛋白质多肽类药物已实现大规模生产，因其不良反应少，易吸收等优点，广泛应用于临床。但该类药物易降解、变性、半衰期短、生物利用度低[1]，常制备成冻干粉末制剂，用于注射给药，并需要多次给药，给患者带来了很大的痛苦。因此开展蛋白质多肽类药物缓释系统的研究具有重要意义。

Chenite等[2]首先报道了壳聚糖/β-甘油磷酸钠（chitosan/β-glycerophosphate，CS/β-GP） 可注射中性温敏凝胶体系，该体系在室温下呈液态，生理温度下凝胶。由于其具有良好的生物相容性，低的免疫原性，抗菌性及细胞亲和性，已广泛应用于组织工程[3-5]及蛋白质类药物传递系统[6-7]。近年来，有学者研究了CS/β-GP凝胶系统成膜后作为生物医用材料的可能性，表明该水凝胶膜生物相容性好，蛋白吸附能力强，但其力学性能较差，药物释放速度快[8-9]，因此不能很好地满足临床需要。

多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）具有独特的力学性能、导电性及热稳定性，但不能很好的溶于水和有机溶剂中，易团聚。研究表明，将聚酰胺 -胺（polyamidoamine dendrimers，PAMAMA）接枝到MMWCNTs上得到的胺功能化碳纳米管具有分散性好、蛋白吸附能力强及细胞毒性低等优点[10-12]。本研究利用CS/β-GP水凝胶体系在37℃发生相变的特性，采用溶剂蒸发法[13]制备CS/β-GP水凝胶膜，利用MWCNTs-PAMAM复合物，增强CS/β-GP膜的机械强度，减慢其释药速率，从而构建一种新型缓释蛋白类药物的材料。

1 材料与方法

1.1 材料

VXC130型细胞破碎仪（美国SONICS公司）；8400S型傅立叶红外光谱仪（日本岛津公司）；SU8010型高分辨场发射扫描电镜（日本电子公司）；ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷冻干燥机（德国Christ公司）；PHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）；INSTRON3366型拉力机（美国英斯特朗公司）；DSA100型接触角仪（德国Kruss公司）；Thermo3001型多功能酶标仪（美国Thermo公司）；聚四氟乙烯模具（4×4 cm，济南岱罡生物工程有限公司）；7301型测厚规（日本三丰精密仪器有限公司）。CS（Chitosan，分子量：100000-300000，批号：20120503，成都市科龙化工试剂厂）；β-GP（β-glycerophosphate，纯度＞97%，上海源叶生物科技有限公司）；羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs-COOH，直径 20-40 nm，长度＜5 μm，纯度＞97%，深圳纳米港科技有限公司）；G 3.0PAMAM（美国 Sigma公司）；1-乙基 -（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCL，北京索莱宝生物科技有限公司）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，北京索莱宝生物科技有限公司）；BSA（Bovine Serum Albumin，纯度＞98%，Sigma）；BCA蛋白浓度试剂盒（Protein Assay Kit，批号：PC0020，北京索莱宝生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 MWCNTs-PAMAM 复合物的制备[10]

称取EDC和NHS各100.0 mg，加入100.0 mL于细胞破碎仪中分散好的0.1 mg/mLMWCNTs-COOH水溶液中，超声 15 min，静置反应 2 h，13000 r/min离心15 min，蒸馏水清洗3-4次。离心后的产物重新分散于蒸馏水中，缓慢滴加适量PAMAM乙醇溶液，超声15 min，避光反应2 h，所得混合液离心分离，纯水透析72 h，双蒸水清洗 3-4次，55℃烘干备用，由热重分析得知MWCNTs-PAMAM复合物中PAMAM的接枝率为6.7%。

1.2.2 水凝胶膜的制备

称取CS 60.0 mg，加入5.0 mL 0.8%的冰乙酸，磁力搅拌 2 h。取 0.9 gβ-GP，溶于1.0 mL去离子水，逐滴加入到CS溶液中，搅拌 30.0 min，加入一定质量的MWCNTs-PAMAM复合物水溶液，搅拌均匀，静置2 h脱泡，测定pH，将混合液注入聚四氟乙烯模具中，水平置入37℃恒温培养箱中，干燥24 h成膜。同时制备空白膜（不加MWCNTs-PAM AM）。用测厚规测定各组膜的厚度。

含BSA复合膜的制备：将10.0 mgBSA溶于500 μL去离子水中，缓慢加入到上述含有MWCNTs-PA MAM的CS/β-GP溶液中，搅拌过夜，静置2 h脱泡，注入聚四氟乙烯模具中，水平置入37℃恒温培养箱中，干燥24 h，制得含0.625 mg/cm2BSA的载药膜。以不加MWCNTs-PAMAM含相同质量BSA的CS/β-GP膜为对照。

1.2.3 SEM表征

将膜于液氮中脆断，冷冻干燥后载于导电胶布上，喷金，SEM观察复合膜的断面及表面形貌。

1.2.4 FTIR表征

将膜干燥后研磨成粉末，进行溴化钾压片，测试分辨率 2 cm-1，扫描范围 4000-400 cm-1，同时采集纯CS、β-GP和MWCNTs-PAMAM 粉末的红外图谱作对照。

1.2.5 溶胀度测定

将膜裁成 1×1 cm大小，37℃干燥至恒重（W0），置于离心管中，加入10 mLpH7.4的PBS溶液，24 h后，擦去表面水分称重（W），计算溶胀比（Rs）。

Rs=[(W-W0)/W0]×100%。

1.2.6 力学性能测试

将膜裁成10×40 mm的长条，测定厚度。室温下采用万能电子试验机测量力学性能，有效长度为20 mm，拉伸速度设定为10 mm/min。

1.2.7 接触角测试

将膜裁成10×40 mm的长条，37℃干燥至恒重，固定于样品台上，蒸馏水作为测试液体，室温下测量液滴刚接触到膜表面的接触角。

1.2.8 降解性能考察

将膜裁成1×1 cm大小，37℃干燥至恒重（W0），置于离心管中，加入10 mLpH7.4的PBS溶液，于恒温水浴摇床中，37℃低速震荡（振荡频率60.0 r/min，振幅24.0 mm），一定时间取出，37℃干燥至恒重（W），计算失重率（WL），绘制时间 -失重率曲线。

WL=[(W0-W)/W0]×100%。

1.2.9 体外释放BSA试验及释药动力学方程拟合

将含有BSA的载药膜裁成1×1 cm大小，置于离心管中，加入10 mL pH 7.4的PBS溶液，于恒温水浴摇床中，37℃低速震荡（振荡频率60.0 r/min，振幅24.0 mm），每隔一段时间取出1 mL释放液，4℃保存，同时补充同温的1 mLPBS，用BCA试剂盒测定释放液中的蛋白浓度，计算BSA累积释放度，绘制释放时间-累积释放度曲线。

累积释放度=（BSA释放量/复合膜中BSA总量）×100%。

以含 0.5 mg/cm2MWCNTs-PAMAM的 CS/β-GP膜为例，应用Origin8.0软件将释放结果用常见的释放动力学模型进行拟合，寻找描述药物释放的最佳模型，初步探讨该复合膜的释药机制。

2 结果与分析

2.1 SEM表征

CS/β-GP膜与 MWCNTs-PAMAM/CS/β-GP膜的SEM表征(图 1)，CS/β-GP 膜断面图（图 1a）显示出该膜具有较疏松的结构，但由于CS/β-GP溶液在挥干成膜后，CS分子与β-GP分子间的疏水作用变小或者消失，使得膜的网架结构出现了一定程度的塌陷，CS/β-GP膜的表面图（图1b）表明该膜表面较为光滑。MWCNTs-PAMAM/CS/β-GP膜断面结构（图 1c）较CS/β-GP膜致密，未见明显团聚体，MWCNTs-PA MAM/CS/β-GP膜表面（图 1d）较 CS/β-GP膜明显粗糙。

图1 CS/β-GP膜与 MWCNTs-PAMAM/CS/β-GP膜的SEM图Fig.1 SEMimages of CS/β-GP film and MWCNTs-PAMAM/CS/β-GP film

2.2 FTIR表征

膜的FTIR表征（图2），CS/β-GP膜的红外图谱中(图2 d)，CS原位于3462 cm-1的羟基（-OH）与氨基（-NH2）重叠振动吸收峰发生了红移变为3400 cm-1，峰形变得平缓，说明重叠的CS的N-H基与β-GP的O-H基结合形成氢键作用。CS的-NH2位于1654 cm-1和1601 cm-1处的I，II的特征峰也发生了红移，暗示-NH2与磷酸根 (PO43-)之间形成离子键。同时无机相PO43-位于900-1200 cm-1处的伸缩振动吸收峰仍存在，说明体系中β-GP只起到中和H+作用。此外，CS的C-H位于2866-2926 cm-1处的对称吸收峰减弱，表明C-H与O-H基之间发生了静电作用。

MWCNTs-PAMAM/CS/β-GP复合膜的红外图谱（图2e）中含有CS/β-GP复合膜和MWCNTs-PAMAM复合物的特征吸收峰，与CS/β-GP膜红外光谱比较可知，位于3400 cm-1和1664 cm-1处的吸收峰随着MWCNTs-PAMAM的加入向低频方向移动，表明-NH2与加入的MWCNTs-PAMAM复合物形成了氢键，推测MWCNTs-PAMAM复合物可以影响膜的网络结构。

2.3 膜的基本性能

CS/β-GP溶液pH为7.15左右，接近生理pH，随着MWCNTs-PAMAM的加入，pH无明显变化，近中性的pH值可以保证蛋白质类药物活性不被破坏（表 1）。

干燥成膜后，含有MWCNTs-PAMAM水凝胶膜厚度较单纯CS/β-GP膜厚度有所下降，这是由于MWCNTs-PAMAM的加入导致复合膜三维网络结构变得结实密集，使得厚度下降，与SEM结果一致。CS/β-GP膜溶胀度仅为50%左右，加入MWCNTs-P AMAM后，溶胀度增大2～4倍，由于加入MWCNTs-PAMAM后，氢键作用增强，有助于增大膜的溶胀度，并且随着 MWCNTs-PAMAM参杂量的增加，溶胀度呈现升高的趋势。

2.4 力学性能测试

膜的力学性能随MWCNTs-PAMAM掺杂量的变化（表2）。加入MWCNTs-PAMAM后，拉伸应力较CS/β-GP膜提高了2～3倍，但随着MWCNTs-PAMAM掺杂量的增加，拉伸应力并没有持续增加，当MWCNTPAMAM的掺杂量为0.7 mg/cm2时，增加量下降，由于MWCNTs长径比大，掺杂量大时，易团聚，受到外力作用易造成应力集中使膜断裂，使得拉伸应力下降。MWCNTs是一种高刚度的材料，因此，掺杂MWCNTs-PAMAM后，膜的弹性模量提高了2-14倍，但加入量为0.7 mg/cm2时，增加有所下降，由于在网状结构中，更多的MWCNTs团聚，使得复合膜弹性模量下降。相对于刚性作用，碳纳米管对复合膜的断裂伸长率贡献不大。

2.5 接触角测试

膜的接触角随MWCNTs-PAMAM掺杂量的变化（图3）。接触角小于90°即表明该材料亲水，因此CS/β-GP 膜（图 a1，a2）及 MWCNTs-PAMAM/CS/β-GP膜 (图 b1-d2)均具有一定的亲水性，由于CS及β-GP中均含有含氧官能团，有利于膜的亲水性，因此CS/β-GP膜具有较好的亲水性，接触角为71.38°±1.07°。当加入MWCNTs-PAMAM后，复合膜的水接触角分别为：63.65°±2.91°，63.15°±3.93°及 61.73°±2.17°，这是由于PAMAM外部具有大量亲水基团，有助于提高膜的亲水性能，因而接触角下降。

图3 不同CS/β-GP膜接触角测试 n=6 Fig.3 The contact angle test of diffirent CS/β-GP films

2.6 体外降解性能

膜的降解性能随MWCNTs-PAMAM掺杂量的变化（图4）。各组膜1 d内均出现明显失重，CS/β-GP膜失重率达62%，含MWCNTs-PAMAM的CS/β-GP膜达53%-58%，由于在溶剂挥发成膜过程中，大量起中和溶液中 H+作用的β-GP沉积在膜结构中，遇PBS溶解，引起膜的明显失重。第2 d开始，各组失重率均有所减慢逐渐趋于平缓，这是由于交联的CS链及与CS物理键合的β-GP维持膜的结构，在近中性环境中，CS几乎不溶解，因此，膜的失重变慢。20 d内，CS/β-GP膜失重率达 88%，掺杂有MWCNTs-PAMAM的CS/β-GP膜达78%-83%，由于掺杂MWCNTs-PAMAM后，膜结构致密，降解较CS/β-GP膜缓慢，并且MWCNTs-PAMAM掺杂量越高，交联程度越高，降解越慢。

图4 掺杂不同质量MWCNTs-PAMAM的CS/β-GP膜体外降解曲线Fig.4 The degradation curves of CS/β-GP films containing diffirent quality of MWCNTs-PAMAM in vitro

2.7 体外释放BSA曲线

膜体外缓释BSA曲线随MWCNTs-PAMAM掺杂量的变化（图 5）。

各组膜在12 h内释放速率均较快，单纯CS/β-GP膜释放量为32%，含MWCNTs-PAMAM的复 合 膜 释 放 量 为 15%～24%。12～48 h内 含MWCNTs-PAMAM的 CS/β-GP膜释放速率有所减慢，累积释放度为31%～43%，而CS/β-GP膜达到55%，这是由于CS/β-GP膜网络支架中的β-GP溶解，更容易形成孔洞，造成BSA释放速度快。48 h后各组膜释放速率均明显减慢并逐渐趋于平缓，CS/β-GP膜16 d内BSA累积释放度达到 76%，而含MWCNTs-PAMAM的CS/β-GP膜BSA累积释放度为60%～68%，且随着MWCNTs-PAMAM复合物质量的增加，BSA的累积释放度减小。

由于MWCNTs-PAMAM的存在，药物分子不易从网络结构中释放出来，在一定程度上减轻了BSA的突释并减缓了其扩散释放。

图5 掺杂不同质量MWCNTs-PAMAM的CS/β-GP膜累积释放BSA曲线Fig.5 The cumulative released BSA curves of CS/β-GP films containing diffirent quality of MWCN Ts-PAMAM

2.8 释药模型的拟合

以含0.5 mg/cm2MWCNTs-PAMAM的水凝胶膜为例进行拟合，各模型拟合方程及拟合相似度见表3，其中Weibull方程的相关系数为 0.99158，为最优模型，即该膜以扩散及溶蚀为释药机制。

3 讨论

通过溶剂挥发法成功制备出含MWCNTs-PAMAM复合物的CS/β-GP水凝胶膜。结果表明，掺杂MWCNTs-PAMAM后，形成的膜表面粗糙，内部结构比较致密，这将有助于细胞的粘附和营养物质的交换，为该膜应用于组织工程方面提供了可能。MWCNTs本身具有增加复合材料力学强度的属性，因此掺杂MWCNTs-PAMAM可以显著增强CS/β-GP膜的力学性能。由于MWCNTs-PAMAM的加入填补了CS/β-GP水凝胶网络的孔隙，影响了凝胶结构，从而为药物的缓释提供了结构基础，同时MWCNTs-PAMAM本身具有强的蛋白吸附能力，在释放过程中，BSA不易解析，一定程度上减缓了BSA的释放，该膜的释药机制比较复杂，药物不仅可以从骨架中扩散出来，并且膜骨架本身也在降解。该水凝胶膜制备工艺简单，条件温和，为应用于植入型缓释蛋白质类药物方面提供了可能，本实验后期将进一步研究该材料的细胞毒性及生物相容性。

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