缺素对土沉香幼苗生长和叶片解剖结构的影响

贾晓红，周再知，梁坤南，余雪标，张金浩

(1.中国林业科学研究院热带林业研究所，广东广州510520;2.海南大学农学院，海南海口570228;3.海南大学环境与植物保护学院，海南海口570228)

土沉香(Aquilariasinensis(Lour.)Gilg)(别名白木香、女儿香、牙香树、莞香、六麻树，为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria spp.)常绿乔木，树皮灰褐色至灰黑色，平滑或有纵皱纹[1－3]，是我国特有的珍贵药用植物[4－5].主要分布于广东省从化、东莞、惠州、高州，海南省安定、保亭、昌江和儋州等地以及云南、广西、福建、台湾等省区.土沉香树脂(沉香)具有较高的药用价值[4，6－7]，随其市场价格的不断攀升[8]，其天然林的乱砍滥伐现象日趋严重.生境的不断破坏和病虫害的发生，加之天然更新能力弱[9]，导致土沉香野生资源不断减少，发展培育土沉香人工林势在必行.近年来，对土沉香研究的力度逐渐加大.杨晓清等[10]以土沉香3个种源的幼苗为供试材料，研究了氮素营养与水分胁迫对土沉香不同种源幼苗相关生理生化指标的耦合影响.万文生等[11－12]通过测定土沉香幼苗在盐分胁迫下的生长与生理特征，探讨其耐盐性.原慧芳等[13]以不同光强适应生长1 a后的4个土沉香种源幼苗为研究对象，对干季和雨季时幼苗叶片进行多项生理生化指标的测定.而在矿质营养诊断和叶片解剖结构的生理响应研究上，尚未见报道.本文采用温室水培法，观测土沉香幼苗在不同缺素情况下(即缺乏氮、磷、钾、钙、镁、铁、锰、硼、锌)的生长指标和叶片解剖结构，探讨其生理适应机制，为土沉香缺素症状的快速诊断和合理施肥提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

采用长势良好、大小均一(平均高度9.2 cm，地径2.1 mm)的海南澄迈土沉香实生苗幼苗，用去离子水洗净根部，置于圆形黑色容器(19 cm×20 cm，容积5 L)内，用海绵固定幼苗，在中国林业科学研究院热带林业研究所温室内进行悬浮培养.

1.2 方法

1.2.1 试验设计 试验采用随机区组设计，重复3次，每个处理3株苗.9个处理分别表示如下.处理1:缺氮处理.处理2:缺磷处理.处理3:缺钾处理.处理4:缺钙处理.处理5:缺镁处理.处理6:缺铁处理.处理7:缺锰处理.处理8:缺硼处理.处理9:缺锌处理.对照为全素营养液处理.

移苗后用1/2浓度的全营养液[14]培养1周;从第2周起，分成9个处理组，采用全浓度方法培养.容器内营养液以淹没土沉香幼苗根系为宜，培养期间每天充氧气1次，持续45 min，每隔1周换1次营养液，并及时清理水箱内的青苔.定期用NaOH或HCl溶液调整箱内pH值至6.5，减少光照温度等外因的干扰，并保持温室内卫生清洁、通气良好.试验期间，温室不使用人工光源，白天平均温度应保持在23－38℃，平均湿度保持在54% －78%.试验时间为2012年9月至2013年6月，持续9个月，观测不同缺素处理幼苗的表型特征.收获时测定幼苗的苗高、地径、生物量，以及植株叶片的解剖结构.

1.2.2 取样调查与指标测定 分别在移苗初期和试验结束时，测量全部幼苗的苗高、地径，计算苗高、地径的增量.

试验结束，测定根、茎、叶及整个植株的鲜重，在70℃烘箱中烘至恒重，分别测定根、茎、叶以及整个植株的干重.根据下列公式计算生物量分配参数:根生物量比(root mass ratio，RMR)=根重/植株总重;茎生物量比(stem mass ratio，SMR)=茎重/植株总重;叶生物量比(leaf mass ratio，LMR)=叶重/植株总重[15].

叶片结构的观察:用石蜡切片法对不同缺素的叶片制作土沉香叶片切片，并用QLYMPUS-BX41型号显微镜进行观察，采用MShot Digital Imaging System进行叶片解剖结构数据标定.

1.2.3 数据处理 用Excel 2007软件对数据进行整理、统计，用SPSS 18.0进行方差分析和Duncan多重比较.

2 结果与分析

2.1 不同缺素处理下土沉香幼苗的症状表现

不同缺素处理下土沉香幼苗的症状表现各异.缺氮症状出现最快，培养3个月左右老叶失绿，新叶发黄;4.5个月后开始出现新叶，呈淡黄色，叶脉突出，老叶也发黄，而且老叶叶尖干枯，继而枯萎脱落.相对于其他缺素处理植株生长缓慢，偏矮小(图1A).缺磷症状出现相对较快，4个月左右出现新叶失绿泛黄，老叶叶片发黄，叶脉突出;5.5个月左右老叶叶尖枯萎卷曲，呈褐色(图1B).缺钾症状出现相对较快，4.5个月左右新叶泛黄，老叶叶脉间失绿，叶脉明显;5.5个月左右老叶出现叶边缘向内逐渐失绿现象，有的老叶叶片上出现黄褐色斑点(图1C).缺钙症状出现相对较快，5个月左右植株老叶叶片开始出现黄色锈斑，新叶失绿变黄;6个月左右，老叶叶片边缘逐渐向内枯萎，新叶呈淡黄色，而且根部开始出现腐烂现象(图1D).缺镁症状出现相对缓慢，6个月左右出现新叶泛黄，老叶叶脉突出;7个月左右老叶叶尖干枯且叶片向内卷曲，新叶叶片缺绿泛黄(图1E).缺铁症状出现相对较快，4.5个月左右出现新叶泛黄发白，呈半透明状，老叶失绿;5.5个月左右，老叶叶片上有坏死斑点，叶尖干枯，叶片边缘向内凹卷，与其他缺素处理植株相比，植株矮小(图1F).缺锰症状表现相对缓慢，6.5个月左右出现新叶泛黄，老叶叶脉突出且叶脉间失绿，叶片边缘干枯，叶片有褐色锈斑且向内卷曲(图1G).缺硼症状表现缓慢，6.5个月左右老叶上有褐色斑点且叶片自边缘向内逐渐变黄，叶脉突出，叶脉间失绿，叶间节缩短(图1H).缺锌症状出现相对缓慢，7个月左右出现新叶泛黄，老叶泛黄且叶片上有锈斑，叶脉突出，叶脉间失绿(图1I).

图1 缺素处理表现症状Fig.1 The symptoms of the treatments of mineral element deficiency

2.2 不同缺素处理对土沉香幼苗生长的影响

从表1可知，缺素处理对土沉香幼苗的苗高、地径以及地上、地下部分生物量和总生物量均有显著影响(P＜0.05).各个缺素处理中除处理9外，其他缺素处理的苗高增量均显著低于对照，其中处理6的苗高增量最小，为2.50 cm，比对照下降了79.8%;处理1和处理7分别比对照下降了77.7%和74.4%.9个缺素处理之间，处理9的苗高增量与其他处理的差异显著，是处理6的4.97倍，仅比对照下降了1.0%.

对照的地径增量显著高于各个缺素处理，9个缺素处理中处理6的地径增量最小，仅为0.93 mm，比对照下降57.9%，处理1和处理7分别比对照下降46.6%和45.7%.9个缺素处理之间的地径增量差异显著，处理9地径增量最大，是处理6(地径增量最小)的1.94倍，仅比对照下降18.6%.

从表1可以看出，全素处理的地上部分生物量、地下部分生物量和总生物量均显著高于各缺素处理(P ＜0.05)，其值分别为各部分生物量最小值的5.04 倍(处理1)、3.53 倍(处理3 和处理4)、4.07 倍(处理1和处理2).总之，9个缺素处理中，对地上部分、地下部分生物量和总生物量影响较大的分别是处理1、处理2、处理3和处理4;各缺素处理之间地上部分生物量与总生物量差异显著，且其最大值(处理7)为最小值(处理1)的4.61倍和3.62倍;而地下部分生物量差异不显著.

2.3 不同缺素处理对土沉香幼苗生物量分配的影响

由图2可知，缺素处理显著影响土沉香幼苗生物量的器官分配比例(P＜0.05).各缺素处理的根、茎、叶生物量比与对照相比，分别下降 0.06 －0.44 g·g－1、0.02 －0.08 g·g－1、0.05 －0.48 g·g－1.其中处理 9的根生物量比最小，为0.20 g·g－1，约占对照的1/3左右;处理2的根生物量比最大，是对照的1.19倍，与处理1相比差异不显著，但与其他处理差异显著.处理2的茎生物量比最小，约占对照的4/5左右;处理5的茎生物量比最大，是对照的1.36倍，与处理1、处理2、处理8的差异显著.处理2的叶生物量比最小，为0.03 g·g－1，仅为对照的1/18左右;处理9的叶生物量比最大，是对照的1.10倍，与其他8个缺素处理的差异显著.

表1 不同缺素处理对土沉香幼苗生长指标的影响1)Table 1 Effects of nutrient deficiency treatments on the growth of A.sinensis seedlings

图2 不同缺素处理对土沉香幼苗生物量分配的影响Fig.2 Effects of different nutrient deficiency on biomass allocation of A.sinensis seedlings

2.4 不同缺素处理对土沉香幼苗叶片解剖结构表皮细胞的影响

通过观察对照叶片解剖结构发现，土沉香幼苗叶片具有典型的双子叶植物叶片的组织结构.叶片上表皮和下表皮均由单行大小不等、形状不规则的细胞组成;在叶片上表皮内整齐紧密地排列着由1层柱状细胞构成的栅栏组织;海绵组织位于栅栏组织与下表皮之间，由大小不等、形状多为椭圆的细胞疏松排列而成.土沉香幼苗经过缺素处理后，其叶片内部组织结构的排列顺序未发生变化，但是其叶片解剖结构的细胞发生了变异.叶片解剖结构显示，缺素处理可使土沉香叶片的表皮细胞发生变异.从表2可以看出，构成各组织的细胞厚度变异较大，各个处理的上表皮细胞厚度大小排列顺序为:对照＞处理7＞处理6＞处理5＞处理9＞处理2＞处理3＞处理4＞处理1＞处理8，处理8的厚度比对照减小了33.3%.各个处理中土沉香幼苗叶片的下表皮细胞厚度大小排列顺序为:处理9＞处理2＞处理5＞处理7＞对照＞处理6＞处理1＞处理4＞处理8＞处理3，其中处理9的下表皮细胞厚度最厚，达到22.67 μm，比对照大0.18倍;处理8的下表皮细胞厚度最薄，仅为14.79 μm，大约是对照的4/5左右.

2.5 缺素处理对叶片解剖结构栅栏组织的影响

缺素处理下，土沉香叶片的栅栏组织细胞排列疏松，有的细胞形状变异为锥形.而且各个处理中栅栏组织细胞厚度差异较大(表2)，其排列顺序为:处理4＞处理7＞对照＞处理2＞处理5＞处理3＞处理1＞处理6＞处理9＞处理8.其中，处理4的栅栏组织细胞厚度最大，为35.16 μm，比对照增大10.6%;处理8的栅栏组织细胞厚度最小，为21.48 μm，比对照减小31.6%.

表2 缺素处理对土沉香幼苗叶片解剖结构的影响Table 2 Effects of different nutrient deficiency on leaf anatomiacal structure of A.sinensis seedlings μm

2.6 缺素处理对叶片解剖结构海绵组织的影响

各个处理中土沉香幼苗叶片的海绵组织细胞变异较大，其中处理5的海绵组织细胞形状多为长柱形，处理6的海绵组织细胞较少，处理8的海绵组织多由2个细胞粘连在一起.各个处理的海绵组织细胞厚度小大排列顺序为:处理6＞处理5＞处理2＞处理3＞处理1＞对照＞处理9＞处理7＞处理4＞处理8，其中处理6海绵组织细胞最厚，厚度为21.48 μm，比对照增大14.0%，处理4海绵组织细胞最薄，厚度为15.03 μm，比对照减小 18.7%(表 2).

3 讨论

3.1 缺素处理对土沉香生长的影响

植物生长发育需要各种矿质元素来维持正常的生理活动[16]，缺乏不同的矿质元素对植株的生长发育会有一定的影响.本试验结果表明，土沉香幼苗在缺乏不同营养元素的情况下，其表型和生长生理指标存在差异，其中影响最为显著的是处理1和处理6.缺氮时，蛋白质、核酸、磷脂等物质的合成受阻，叶绿素的合成也会受到一定影响，致使植株生长矮小、枝叶发黄、叶片早衰干枯，这与檀香(Santalum album)苗木缺氮出现的表型症状[17]一致.铁元素是叶绿素合成所必需的营养元素，直接影响植株叶绿体的构造，因此缺乏铁元素容易造成土沉香苗木叶片“黄叶病”的发生，这与柚木(Tectona grandis)苗木缺铁表型症状[18]吻合.王金花等[19]在人工气候室条件下，采用溶液培养法对缺锌条件下的2种苹果砧木幼苗进行研究，发现其均出现不同程度的植株矮小、新生叶片黄化且簇生、节间缩短、根尖膨大等缺锌症状.缺锌使灰杨(Populus×canescens)的根、叶、茎、皮鲜重显著降低，茎直径和叶片数显著下降[20].本研究结果显示，处理9的土沉香幼苗的苗高增量和叶片厚度等指标与对照没有显著差异，说明锌元素对土沉香幼苗的生理生长影响较小，这与上述研究有所差异，可能是试验树种差异或者土沉香幼苗对于锌元素营养缺乏反应迟钝、养分吸收效率差等造成的.

3.2 缺素处理对土沉香生物量分配的影响

植物生长在缺素环境下，通常是通过生理生化作用进行自身调节的，进而在生物量分配方面得到体现.因此，植物生物量分配可以作为反映植物受到缺素影响程度的重要指标，在一定程度上反映了其在不同生境条件下自身的生长发育状况[15，21].本试验结果表明，缺磷处理使土沉香幼苗通过调节其各部分生物量比值来适应缺素环境，这是由于缺磷时蛋白质合成受阻，影响细胞分裂，因此地上部分生物量比减小.土沉香不同部位生物量分配差异的内在原因尚不十分清楚，有待于进一步研究.

3.3 缺素处理对土沉香叶片解剖结构的影响

吴月娥等[22]观察了枇杷幼苗缺磷、钾、钙时的外部症状和内部组织解剖结构，结果表明缺素致使叶片栅栏组织、海绵组织发生变化.本研究结果表明，缺素环境下土沉香幼苗叶片组织解剖结构的细胞发生了很大变异，导致其叶片的厚度有差异.而植物的叶片厚度反映叶肉细胞的数量，从而影响其他生长生理指标.其中影响最为明显的是硼元素，它能参与植物糖的运转与代谢，促进蔗糖的形成，而且还能抑制有毒酚类化合物的形成.在缺硼的环境下，土沉香幼苗叶片内可能出现糖合成受阻、有毒酚类化合物含量增高等现象，从而叶片组织细胞结构发生变异，其叶片组织排列疏松，叶片厚度大幅减小，从而导致其生理功能受到影响.

本试验仅采用水培法对土沉香无性系幼苗进行缺素培养，其缺素表现症状出现缓慢，培养时间较长，主要原因可能是土沉香叶革质耐贫瘠，对缺素培养的反应不灵敏.

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