低等级胚胎囊胚培养及冻融周期移植后临床结局分析

王雅琴，杨菁，徐望明，吴庚香

（武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉 430060）

在辅助生殖技术（ART）中，对低等级胚胎的处理一直是生殖领域棘手的难题，一方面低等级胚胎移植后种植率低，另一方面冷冻后复苏率低。这部分胚胎是直接废弃，还是有继续利用的临床价值？目前在生殖医学界尚无明确定论。随着囊胚体外培养体系的不断优化，囊胚培养作为一种对胚胎发育潜能进一步筛选的方法，已被广泛应用于临床［1］。由于囊胚培养有一定的淘汰率，既往的研究认为，当第3天（D3）有3个以上8细胞的优质胚胎时，可以考虑行囊胚培养筛选优质胚胎进行移植，从而提高种植率及临床妊娠率［2］。但对于多个低等级胚胎，囊胚培养是否有助于其筛选出有发育潜能的胚胎、增加妊娠机会，仍有待临床进一步考证。本研究主要应用鲜胚周期D3的低等级胚胎继续进行体外囊胚培养，观察囊胚形成情况及相关临床资料，并进一步追踪鲜胚周期未妊娠续行冻融周期囊胚移植患者的临床妊娠结局，以评价低等级胚胎行囊胚培养及移植的可行性，为提高低等级胚胎的有效利用和临床囊胚移植寻找理论依据。

资料与方法

一、研究对象

选择2012年1月至2014年3月在我院生殖医学中心接受体外受精-胚胎移植或卵胞浆内单精子注射-胚胎移植（IVF-ET／ICSI-ET）的679例不孕症患者684个周期不符合冻存标准的3 536个剩余低等级胚胎进行囊胚培养，回顾性分析患者鲜胚周期各临床指标参数以及鲜胚未妊娠冻融囊胚复苏后的临床妊娠情况。本研究得到了医院伦理委员会的批准，并与患者签署知情同意书。

二、方法

1.临床促排卵方案和移植时间：促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a，达必佳，辉凌公司，德国）0.1mg／d注射后14～16d达到垂体降调节后给予促性腺激素，阴道B 超监测卵泡直径发育至至少有两个主导卵泡的直径达18mm 以上时，注射人绒毛膜促性腺激素（HCG，珠海丽珠）8 000～10 000U，36～37h后经阴道超声下穿刺取卵，取卵后72h选取2个胚胎进行移植。

2.囊胚培养和囊胚评级：将新鲜胚胎移植后（或全胚冷冻周期）D3剩余的优胚进行冷冻，其它低等级胚胎转行囊胚培养，使用Quinns AdvantageTM囊胚培养基（SAGE，美国）进行胚胎体外培养。本研究中低等级胚胎的纳入标准是D3低等级胚胎数≥4个，胚胎卵裂球数在3～5 个、胚胎碎片在5%～20%。卵裂球数＜3个细胞或碎片＞20%的质量极差胚胎不纳入本研究低等级胚胎中。所有低等级胚胎行囊胚序贯培养至D5／D6，观察是否有囊胚形成，并对形成的囊胚选用Gardner等［3］分级方法进行分级，D5评分≥3BB 为优质囊胚，≥3CC 行囊胚玻璃化冷冻保存。

3.解冻囊胚并行冻融周期囊胚移植：采用人工周期或自然周期准备内膜，在黄体酮注射5d后进行超声引导下囊胚移植。囊胚在移植前1d解冻并体外培养。

4.妊娠确认：移植后12d抽血测HCG，阳性者诊断为生化妊娠，移植后30d行阴道B 超见孕囊者则诊断为临床妊娠。

5.观察指标：观察低等级胚胎的囊胚形成率、优质囊胚形成率、鲜胚周期临床妊娠率、种植率、流产率及宫外孕率，冻融周期囊胚移植的种植率、妊娠率、流产率及异位妊娠率。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计数资料用率（%）表示，采用χ2检验；计量资料采用（±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、囊胚培养情况

患者年龄22～41岁，平均年龄（31.0±4.6）岁，共684个周期的3 536枚胚胎进行囊胚培养（平均每周期4～12 个胚胎），有475 个周期形成囊胚1 187个，囊胚形成率为33.6%，209个周期无囊胚形成。根据患者年龄将患者分为＞35岁组和≤35岁组，结果显示＞35岁组囊胚形成率为21.9%，≤35岁组囊胚形成率为34.6%，差异有统计学意义（P＜0.05）。根据有无囊胚形成将患者分为有囊胚形成组与无囊胚形成组，比较两组间平均年龄、获卵数、基 础FSH 值、Gn 天 数，Gn 用 量，HCG 日E2值，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。进一步将获卵数分为≤10个组和＞10个组，结果显示，≤10个组有囊胚形成周期比率为61.4%，无囊胚形成周期比率为38.6%；＞10个组有囊胚形成周期比率为79.2%，无囊胚形成周期比率为30.8%。比较两组间受精方式与囊胚形成的关系，有囊胚形成组IVF周期比率为69.1%，ICSI周期比率为30.9%；无囊胚形成组IVF周期比率占46.2%，无囊胚形成组ICSI周期比率占53.8%。

二、鲜胚移植周期与囊胚形成率的关系

新鲜周期胚胎移植患者中，有囊胚形成组426个周期，无囊胚形成组187个周期，有囊胚形成鲜胚移植组受精率、临床妊娠率、种植率显著高于无囊胚形成组，流产率低于无囊胚形成组，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

三、囊胚解冻复苏后临床妊娠情况

共122个周期鲜胚移植未妊娠患者进入冻融囊胚周期，共解冻低等级胚胎囊胚培养形成的囊胚220个，囊胚复苏率为81.4%（179／220），共111个周期成功复苏囊胚并移植。平均移植囊胚数为（1.6±0.2）个，囊胚移植周期临床妊娠率（40.5%），种植率（27.4%），流产率（8.89%），与同期卵裂期胚胎冻融周期临床妊娠率（43.0%）、种植率（24.0%）、流产率（7.8%）比 较，两 组 间 差 异 无 统 计 学 意 义（P ＞0.05）；囊胚移植组复苏率（81.4%）、异位妊娠率（8.9%）与同期卵裂期胚胎冻融周期复苏率（94.4%）、异位妊娠率（3.7%）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

四、冻融周期囊胚移植异位妊娠发生情况

111个冻融周期囊胚移植中45 个周期临床妊娠，共有4例发生异位妊娠。其中，输卵管妊娠3例，卵巢妊娠1例，移植囊胚均为优质囊胚（表4）。

表1 有囊胚形成组与无囊胚形成组一般情况的比较（±s）

表1 有囊胚形成组与无囊胚形成组一般情况的比较（±s）

组 别 例数 年龄（岁）不孕时间（年）获卵数（个）bFSH（U／L）Gn用量（支）Gn天数（d）HCG 日E2 值（pmol／L）1.4 11.7±2.2 15 510.3±7 265.8无囊胚形成组 209 31.1±4.6 3.9±3.0 14.2±6.6 6.9±3.4 29.9±1有囊胚形成组 475 30.8±4.2 4.1±2.5 17.7±6.4 6.3±3.1 28.7±1 4.3 11.5±2.6 14 609.3±6 869.1

表2 有囊胚形成移植组与无囊胚形成移植组指标比较（n，%）

表3 冻融囊胚移植组与卵裂期胚胎移植组间妊娠情况比较

表4 囊胚移植后异位妊娠患者移植囊胚情况

讨 论

胚胎形态学评分是目前最常用的胚胎评估方法［4］，卵裂期胚胎评分主要对卵裂球数目、细胞均匀程度以及碎片多少进行评估，具有无创、快速、简便的优点。临床上对卵裂期胚胎形态学评分为低等级胚胎的处理尚无定论，目前多数学者建议可继续行囊胚培养进行筛选。尽管与优质胚胎相比，低等级胚胎囊胚形成率较低，但进一步延长体外培养时间可以让其有更多自我选择的机会［5］。如发生胚胎发育阻滞，可以及早取消避免无效移植。本研究共纳入了3 536个D3形态学评分判定为低等级胚胎，获得了33.6%的囊胚形成率，并在冻胚周期囊胚复苏移植后获得了40.5%的临床妊娠率。本结果提示：胚胎的发育潜能并非与其形态完全一致，即使形态学评分为低等级的胚胎仍有获得优质囊胚的可能，仅仅根据常规的卵裂期胚胎形态学评分来预测胚胎的发育潜能仍有相对的局限性。临床上对剩余的低等级胚胎可延长体外培养时间培养至囊胚，筛选出具有发育潜能的胚胎并冷冻保存，从而可以最大限度地利用胚胎，增加患者妊娠机会。

回顾性分析鲜胚周期低等级胚胎囊胚形成影响因素中，我们发现＞35岁组囊胚形成率明显低于≤35岁组，提示年龄是影响低等级胚胎囊胚形成的原因之一，年龄越大，胚胎发育潜能下降。此外，研究中比较无囊胚形成组与有囊胚形成组间获卵数无统计学差异，但进一步将获卵数分为≤10 个组和＞10个组，结果发现≤10个组无囊胚形成周期比率明显高于＞10个组，这一结果提示，对于获卵数及胚胎数较少、且胚胎质量不佳者，进一步行囊胚培养可能增加患者无胚胎移植风险。研究中比较受精方式与囊胚形成关系中发现，无囊胚形成组ICSI周期比率明显高于无囊胚形成组，分析原因可能与男方精子质量与胚胎发育潜能有一定的关系。

进一步分析鲜胚周期剩余低等级胚胎囊胚形成率与临床妊娠率的关系时发现，剩余胚胎有囊胚形成周期的受精率、优胚率、临床妊娠率及种植率均显著高于无囊胚形成周期，这与大部分文献报道［6］结果一致。胚胎能否逾越8细胞阻滞期发育到囊胚，往往可间接预示着本周期其它胚胎的种植能力。本研究中有111个周期鲜胚移植后有囊胚形成而未妊娠者继续行冻融周期囊胚移植，囊胚移植组临床妊娠率、种植率及流产率与同期卵裂期胚胎移植周期比较无统计学差异。本结果还提示通过囊胚培养对低等级胚胎进行筛选，一旦形成囊胚并在冻融周期行囊胚移植可达到与卵裂期冻胚移植相似的妊娠率和种植率，最大程度地增加了患者累积妊娠率，从而改善辅助生殖助孕结局。

与自然妊娠相比，IVF 周期异位妊娠率提高了接近2.5～5倍。ART 中发生异位妊娠可能与输卵管病变、子宫内膜异位症致盆腔微环境改变、移植管的置管深度、移植时的推注速度、植入胚胎的数目、移植的时机、胚胎在宫腔内游走及胚胎与子宫内膜发育的同步性等因素有关［7-8］。有研究显示，与D2移植比较，D3移植异位妊娠率有降低的趋势，原因可能与随着黄体期的延长，子宫收缩力降低有关。Fanchin等［9］研究发现，与HCG 当日比较，HCG 日后7d从宫底至宫颈的子宫收缩运动明显减少。与卵裂期胚胎移植相比，囊胚期移植理论上更符合自然生理规律，更接近子宫内膜的开窗期，且囊胚期卵巢黄体分泌孕酮更为旺盛，使得子宫壁及输卵管运动收缩明显减弱，加上囊胚体积较大，运动游走更为困难，以上因素均有利于减少异位妊娠的发生。然而，在本研究中我们发现冻融周期囊胚移植组异位妊娠率高于卵裂期胚胎移植组，分析原因可能与样本量尚小可能影响结果偏倚有关，我们将继续扩大观察样本严密追踪。此4例囊胚期移植宫外孕患者均移植的是优质囊胚，3例为输卵管妊娠，另1例为较罕见的卵巢妊娠，此现象说明囊胚移植至宫腔后仍能发生远处游走。近年关于囊胚期移植是否降低异位妊娠率仍有一定的争论［10-11］，我们目前的数据尚无足够的统计学证据表明囊胚移植可以降低异位妊娠的风险，我们认为，不应为避免异位妊娠而选择囊胚移植。

综上所述，我们认为，对胚胎质量的评估手段依然需要不断完善，对形态学评估为低等级的胚胎不应完全放弃，囊胚培养可帮助筛选出有发育潜能的胚胎，以增加胚胎的有效利用率和累计妊娠率。对于高龄、获卵数少的患者，行低等级胚胎囊胚培养具有一定的风险，需谨慎。囊胚培养不能降低异位妊娠及流产的发生风险。尽管有学者对发育滞后的低等级胚胎持有应用安全性方面的疑问，比如囊胚培养延长体外培养时间，增加单卵双胎率及影响胚胎的基因表达和表观遗传修饰等风险，但这些问题都有待于进一步研究探索。

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