禽源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性检测

黄迪海 秦春芝 盛晓丹张从敬 郭 卉 刘 霞 徐秀荣 秦卓明③*（①山东省健牧生物药业有限公司 济南 250100 ②济南市动物生物药品工程技术研究中心③山东省农业科学院家禽研究所 济南）

禽源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性检测

黄迪海①②秦春芝①②盛晓丹①②张从敬①②郭 卉①②刘 霞①②徐秀荣①②秦卓明①②③*（①山东省健牧生物药业有限公司 济南 250100 ②济南市动物生物药品工程技术研究中心③山东省农业科学院家禽研究所 济南）

了解规模化养禽场的大肠杆菌耐药情况，为合理选择抗生素提供参考。对山东、河北等地2013～2014年送检病禽进行细菌分离鉴定，对获得的大肠杆菌用17种药物进行敏感性试验。结果表明：在分离鉴定的28株大肠杆菌中，有27株对17种药物存在不同程度的耐药性。其中，对氨苄西林、氯霉素高度耐药，分别为96.43%和89.29%；对阿米卡星、多粘菌素和加替沙星耐药率较低分别为32.14%、35.71%和42.86%，对舒巴坦钠与氨苄西林、头孢曲松、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟的组合物耐药率最低，为7.14%。研究发现大肠杆菌分离株的耐药性较为严重，应高度重视对大肠杆菌的耐药性跟踪监测并根据药敏结果筛选合适的药物。

大肠杆菌 分离 鉴定 耐药性

禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的家禽局部或全身性疾病，是危害家禽养殖业的主要传染病之一。禽致病性大肠杆菌感染还可以作为禽流感、新城疫、传染性支气管炎等病毒性疫病的继发病出现，进一步加剧疫病的危害[1]。在家禽养殖过程中，对禽大肠杆菌病的防控主要通过药物预防和治疗，但由于该菌耐药性较强、药敏检测结果滞后、部分养殖场不具备药敏检测条件等原因，敏感药物的筛选和及时应用具有一定难度。

本试验通过对2013～2014年间在山东、河北、河南、辽宁等北方地区分离鉴定的禽大肠杆菌进行药敏试验，筛选敏感药物，进而为大肠杆菌防治提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 采集山东、河北、河南等省送检的、具有典型心包炎和肝周炎的病鸡26批次和病鸭2批次，进行大肠杆菌分离和纯化，获得28个菌株，经革兰氏染色形态学观察和生化试验，鉴定为大肠杆菌(见表1)。质控菌株为大肠杆菌ATCC 25922，购自中国兽医药品检验所。

表1 大肠杆菌分离株的来源 (株)

1.1.2 培养基和试剂 麦康凯培养基购自国药集团化学试剂有限公司，MH肉汤、LB肉汤、普通营养琼脂培养基、葡萄糖、甘露醇、麦芽糖等生化培养基为北京奥博星生物技术有限公司产品，磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠为中国上海试剂总厂产品。

1.1.3 药敏片 标准药敏片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；复方药敏片为自制，方法是用单方标准药敏片，滴加40%舒巴坦水溶液20μl，37℃烘干8h，即每片含舒巴坦8μg；药敏试验判断标准见表2。

表2 药敏试验判断标准 (μg×片-1)

1.2 方法

1.2.1 生化特性 按常规方法[2]，将纯化的疑似大肠杆菌培养物分别接种至葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、乳糖、尿素、三糖铁培养基、枸橼酸盐培养基、甲基红试验和吲哚试验的生化常规微量发酵管中及糖蛋白胨水溶液后，置于37℃培养箱中培养2～3d，观察其变化。

1.2.2 药敏试验 按照WHO推荐的Kirby－Bauer法[3]进行药敏试验。

2 结果

2.1 生化反应

试验表明，28株疑似致病性大肠杆菌均符合大肠杆菌的生化特性，能分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖，产酸产气；甲基红试验、吲哚试验均为阳性；在三糖铁培养基上不产生硫化氢，不水解尿素，在枸橼酸盐培养基上不生长。

2.2 药敏试验结果

表3 28株大肠杆菌对17种药物的敏感性试验结果 (株、%)

由表3可见，28株受检菌中，除1株对17种药物均敏感外，27株对上述药物均有不同程度的耐药，其中，对氨苄西林、氯霉素耐药率较高，分别为96.43%和89.29%，对头孢呋辛、头孢克洛、依诺沙星耐药率均为82.14%；对复方药敏片的耐药率最低，仅为7.14%，较单方平均耐药率73.57%具有显著变化；对阿米卡星、多粘菌素、加替沙星的耐药率均低于43%。值得关注的是，山东潍坊市分离株对加替沙星的耐药率仅为11.11%(1/9)，而山东高青县分离株对阿米卡星的耐药率达80%(4/5)；山东高青县和阳谷县各有1株大肠杆菌对单方药敏片全部耐药，对复方药敏片全部敏感。28株受检菌中，3株来自山东潍坊市的大肠杆菌未表现出多重耐药特点，其余25株均为多重耐药。由图1可见，85.7%的菌株对6种及6种以上药物耐受，其中，山东分离株占71.4%，其它占14.3%；耐药类型为7～10重类型的大肠杆菌比例最大，占受检菌的60.71%。对被测药物耐受种类最多的大肠杆菌有2株，仅对加替沙星/多粘菌素B、加替沙星/阿米卡星敏感，耐药类型为15重耐药，占受检菌的7.14%，来自于山东宁阳县和福山区。

图1 28株大肠杆菌多重耐药类型图

3 讨论

（1）本研究分离鉴定的28株大肠杆菌来源于山东省10个地市、河北沧州、河南郑州及辽宁锦州规模化养禽场，多重耐药率占89.29%，说明上述区域大肠杆菌耐药性较强。分离株对上述养殖场常用药物氨苄西林耐药率高，对较少使用的多粘菌素、阿米卡星、加替沙星耐药率较低，与当前的研究[3,4]一致。分离株对兽医尚未应用的头孢呋辛、头孢克洛和依诺沙星耐药率高达82.14%，可能与大肠杆菌产生β-内酰胺酶水解β-内酰胺类药物[5]和GyrA基因突变耐喹诺酮药物[6]的耐药机制有关，提示我们在用药过程中要关注病原菌对同类抗菌药物的共同耐药机制，合理选择抗菌药物。（2）本试验证实舒巴坦与β-内酰胺类药物合用在体外对山东等地区的禽源大肠杆菌具有协同增效作用，可将大肠杆菌的平均耐药率由75%降至7%，尤其是对兽医常用药物氨苄西林效果最为显著，93%的大肠杆菌对其药敏试验结果由耐药变为敏感。该作用产生的原因是舒巴坦不可逆的与大肠杆菌产生的β内酰胺酶结合，阻止了该酶对β-内酰胺类抗菌药的水解作用。研究表明舒巴坦在人[7]和动物体内[8,9]对β-内酰胺类药物也具有显著的增效作用，但是舒巴坦口服吸收差，仅适合注射使用。为此，阿根廷的Laboratorios Bago S.A开发上市了口服吸收良好的舒巴坦匹酯；美国Pfizer和丹麦Leo公司研制出口服药物舒他西林(舒巴坦与氨苄西林以酯链相缩合成双酯型前体药物)，1986年在日本上市[10]。在我国，口服使用的阿莫西林舒巴坦匹酯、舒他西林及阿莫西林克拉维酸复方制剂已在人医领域上市应用。在兽医领域，β-内酰胺类抗菌药+β-内酰胺酶抑制剂仅有阿莫西林克拉维酸复方产品。在畜禽致病菌耐药性不断增强的情况下，一方面要规范使用抗生素，另一方面要开发和应用安全、有效、质量可控的复方抗菌制剂，降低细菌性传染病对养禽业造成的危害。

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S852..61+2

A

1007-1733(2015)11-0011-03

2015-09-06）

科技部农转资金项目(SQ2013ECC600059)；济南市科技成果转化项目(201211063)。

*通讯作者