牛奶中林可霉素磁免疫化学发光检测方法的建立

聂雯莹 罗晓琴 杜美红 王兆芹* 冯月君 陈炜玲（①北京勤邦生物技术有限公司 102206 ②北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心北京市理化分析测试中心）

牛奶中林可霉素磁免疫化学发光检测方法的建立

聂雯莹①②罗晓琴①②杜美红③王兆芹①②*冯月君①②陈炜玲①②（①北京勤邦生物技术有限公司 102206 ②北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心③北京市理化分析测试中心）

林可霉素药物中的醇羟基经PDC氧化后得到酮基林可霉素，然后与氨基丁酸进行缩合反应，得到四碳链羧基半抗原产物，即林可霉素半抗原；将辣根过氧化物酶标记林可霉素半抗原，制备得到酶标抗原；将林可霉素半抗原分别与BSA和OVA偶联，制备得到免疫原和包被原，进而制备得到林可霉素单克隆抗体，测得抗体效价为1:180000；将林可霉素单克隆抗体与磁珠偶联得到磁标抗体；配合全自动磁免疫化学发光仪建立了化学发光免疫检测方法，建立了林可霉素磁免疫化学发光检测试剂盒标准曲线，测得该方法对牛奶中林可霉素的检测限为5.88μg/L，该方法对林可霉素具有较高的特异性，对与林可霉素结构或者功能相似竞争的9种药物均无交叉反应。进行牛奶空白样品添加试验时回收率为85.8%～113.3%，批内变异系数为5.4%～8.6%，批间变异系数为8.4%～9.1%。该方法试剂盒配合全自动磁免疫化学发光仪检测，具有灵敏度高、特异性好、操作简单、检测时间短等优点，适合对乳制品安全监管和企业内控工作中推广应用，为我国乳制品监管工作提供了技术支持。

林可霉素 牛奶 磁免疫化学发光 试剂盒 全自动磁免疫化学发光仪

林可霉素(Lincomycin, LIN)又称洁霉素，是由林肯链霉菌发酵产生的林可酰胺类抗生素[1]，具有较强的抑菌活性，主要作用于革兰氏阳性细菌[2-3]，林可霉素用作饲料添加剂，有提高增重速率的功效。使用方法主要是添加林可霉素制品混合于饲料中使用，或采用直接注入患病乳牛乳房治疗奶牛乳房炎，两种给药方式都会造成药物在牛乳中残留。我国食品卫生法规定，在应用抗生素期间和停药后5d内的乳不能食用，牛奶中的林可霉素残留，可通过食物链进入人体后累积可以导致细菌耐药性[4]。农业部235号公告规定了林可霉素在牛奶中的最大残留限量为150μg/kg。林可霉素残留量常用的检测方法主要有微生物法[5]，高效液相色谱法(HPLC)[6-9]、气相色谱法(GC)[10-11]、高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)[12-13]、液相色谱/质谱联用技术(LC-MS)[14]、薄层色谱法[15]。本试验建立了一种高效快速检测牛奶中林可霉素的磁免疫化学发光检测方法，并配合全自动化学发光仪，实现检测过程的全自动化，减少人为操作误差，方法灵敏度、特异性和准确度较高，检测时间短，检测过程只需10min，适用于大批量牛奶样品中林可霉素的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

林可霉素Sigma公司；辣根过氧化物酶Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)和二甲基甲酰胺(DMF)Sigma公司；弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)北京勤邦生物技术有限公司制备；羧基磁性微珠Thermo Fisher Scientific公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。全自动磁免疫化学发光仪，北京勤邦生物技术有限公司；FA2104型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；DHP-600型生化培养箱，天津市中环实验电炉有限公司；Milli-Q Reference纯水仪，美国Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 林可霉素半抗原合成 取1.0g林可霉素加入到乙腈中溶解，再加入0.82g重铬酸吡啶(PDC)，搅拌，加入0.8ml乙酸酐和0.5ml乙酸，室温搅拌6h，待反应完全，停止反应并蒸干，上硅胶柱纯化，乙酸乙酯：石油醚=1:1洗脱分离，得到产物1。取产物1加甲醇溶解，再加1.2g氨基丁酸水溶液3ml和0.5g氢氧化钾的水溶液2ml，于60℃加热反应7h，反应完全，停止反应，旋蒸，加水，调节pH值至6，加乙酸乙酯萃取，蒸干，得到无色油状物，再加乙醇重结晶得到林可霉素半抗原产物。合成路线如图1所示。

图1 林可霉素半抗原合成路线图

1.2.2 酶标抗原的制备 取10mg林可霉素半抗原，溶于1ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；取30mg二氯乙烷(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用0.2ml水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取辣根过氧化物酶(HRP)50mg，使之充分溶解在3.8ml磷酸盐缓冲液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到HRP溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到林可霉素酶标抗原；分装，于-20℃保存备用。

1.2.3 免疫原的制备 将HRP 50mg替换为牛血清白蛋白（BSA）50mg，制备方法同上，得到免疫原。

1.2.4 单克隆抗体的制备 （1）动物免疫：用上述制备出的免疫原按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射。第3次免疫后，每次免疫后7d，眼眶上缘采血分离血清，间接ELISA法测定血清抗体效价，根据测定结果决定融合时机。细胞融合前3～5d进行冲击免疫，腹腔注射免疫原100μg/只。（2）细胞融合：取冲击免疫后的小鼠的脾细胞与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后再45s内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000）进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5%CO2培养箱中培养，5d后用HT培养基半换液，8d后进行全换液。（3）杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛采用间接ELISA方法，以包被抗原（预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度）包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入林可霉素标准品50μl，再加入细胞上清液50μl和羊抗鼠IgGHRP 50μl，于37℃反应30min，洗板，再加入底物液显色液100μl，于25℃下避光反应15min，再加入终止液50μl，测定OD450nm值下降到对照孔的50%以下，判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。（4）单克隆抗体制备：将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，7～10日后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×106/只，7～10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。

1.2.5 磁标抗体的制备 （1）磁珠活化：表面有- COOH基团的磁珠(粒径为2.8μm)，其含量是0.1eq/g，取100μl磁珠，用含有pH5.0、0.05%的吐温-20的浓度为25mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)100ml洗涤两次，磁分离后移除上清；磁珠活化前，用4℃贮存的上述MES溶液分别配制50mmol/L的EDC和NHS溶液；分别向装有磁珠的离心管中加入新配置的EDC和NHS溶液各50μl，涡旋混匀，室温活化30min；将离心管置于磁分离架上进行磁分离4min，移除上清液，再向其中加入100μl、pH5.0、25mmol/L的MES清洗2～3次后即可得到表面有羧基活化的磁珠。（2）磁珠偶联林可霉素单克隆抗体的制备：将10μg林可霉素单克隆溶解到60μl、pH5.0、25mmol/L的MES中，向其中加入3mg活化的磁珠，并用上述浓度MES溶液调节总体积至100μl，轻柔地混匀磁珠与林可霉素单克隆抗体；室温条件下偶联30min或4℃偶联2h，该期间可利用涡旋仪使磁珠保持混匀状态；离心管置于磁分离架上进行磁分离5min，移除上清液；为了淬灭未反应的-COOH，可加入100μl、pH7.4的三羟甲基氨基甲烷(TRIS)反应15min；用100μl、0.1%BSA、0.1%吐温-20的盐酸盐缓冲液(PBS)清洗封闭好的磁珠3～5次，将磁珠复溶于含0.1%的BSA、0.05%吐温-20、0.02%NaN5的磷酸盐缓冲液中，得到磁标抗体，于2～8℃保藏。

1.2.6 化学发光免疫检测方法的建立及评价 （1）将酶标抗原稀释液装入化学发光检测仪酶标抗原工作液容器中；将磁标抗体稀释液装入化学发光检测仪酶标抗原工作液容器中；对每个样品/标准品设置样品架上的位置，输入样品信息和需要检测的测试项目名称；将样品管/标准品管放入已设定好的样品架上，化学发光检测仪依次吸取50μl酶标抗原、50μl待测样品/标准品和50μl磁标抗体加入到反应杯中，混匀，并在室温下反应15min，再通过清洗装置进行磁分离3min，再用PBS清洗3次，再加入化学发光底物A液和B液各50μl，检测其发出的相对光强度(RLU)，样品中林可霉素的含量与RLU成负相关关系，可以通过RLU结合标准曲线法计算林可霉素的浓度。（2）标准曲线：配制林可霉素标准品溶液终浓度分别为0、0.3、0.9、1.8、3.6和10.8μg/L，绘制标准曲线。（3）检测限：对20份含林可霉素的空白牛奶样品进行检测，测定结果的平均值加上3倍标准差为该方法对实际样品的最低检测限。回收率：取空白牛奶样品，分别向其中添加林可霉素标准品至终浓度为6、12、24μg/L，每个浓度作3个平行，计算添加回收率和精密度。添加回收率=实测值(μg/L)/添加值(μg/L)×100%。（4）特异性：选择九种结构相似的化合物(克林霉素、北里霉素、螺旋霉素、红霉素、泰乐菌素、替米考星、安普霉素、泰妙菌素、大观霉素)进行交叉反应试验，测定单克隆抗体的特异性。

2 结果

2.1 林可霉素半抗原

林可霉素是小分子药物，没有免疫原性，不能刺激机体产生针对林可霉素抗原的特异性抗体[16]，本研究林可霉素药物中的醇羟基经PDC氧化后得到酮基林可霉素，然后与氨基丁酸进行缩合反应，得到四碳链羧基半抗原产物。林可霉素半抗原再与载体蛋白偶联得到免疫原，使得免疫原决定簇充分暴露出来，机体更容易识别抗原决定簇，免疫动物产生的抗体就会在亲和力和特异性上最大程度的与抗原决定簇拟合。林可霉素半抗原产物经核磁氢谱测定，如图2所示，化学位移δ=11mg/kg的位置为羧基氢共振吸收峰，化学位移δ=2.3、1.6、1.3ppm的位置为间隔臂上亚甲基的氢共振吸收峰，证明间隔臂连接成功，林可霉素半抗原合成成功。

图2 林可霉素半抗原核磁共振氢谱图

2.2 单克隆抗体效价

通过效价测定，本试验制备的林可霉素单克隆抗抗体的效价在1:180000。

2.3 化学发光免疫检测方法的建立及评价

建立配套全自动化学发光仪建立牛奶中林可霉素残留磁免疫化学发光检测方法。

2.3.1 标准曲线的建立 从图3中可以看出，得到的曲线线性方程为y=-3.1505x-0.3887(线性相关指数R2=0.9966)，其中纵坐标为RUL/RUL0值，横坐标为林可霉素标准品浓度值。?

图3 林可霉素磁免疫化学发光检测试剂盒标准曲线

2.3.2 检测限 根据对20份空白牛奶样品的检测结果，并利用公式计算检测限结果，见表1，得到试剂盒对牛奶样品中林可霉素的最低检测限为5.88μg/L。

表1 试剂盒对牛奶样品的检测限 (μg/L)

2.3.3 试剂盒特异性 选择与林可霉素有类似结构和类似功能10中药物，用试剂盒测定交叉反应率，结果如表2所示。

表2 林可霉素单克隆抗体交叉反应率 (%)

由表2可知试剂盒的林可霉素单克隆抗体对林可霉素具有较高的特异性，对与林可霉素结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。

2.3.4 准确度和精密度 通过对林可霉素添加浓度分别为6、12和24μg/L的样品进行检测，计算回收率得到试剂盒的准确度和精密度，实验结果见表3。从表3可知，试剂盒对牛奶样品中林可霉素测定的添加回收率为85.8%～113.3%，批内变异系数为5.4%～8.6%，批间变异系数为8.4%～9.1%，批内变异系数均小于10%，批间变异系数小于15%。

表3 准确度和精密度试验结果 (μg/L、%)

3 结论

林可霉素是小分子药物，没有免疫原性，不能刺激机体产生针对林可霉素抗原的特异性抗体，本研究林可霉素药物中的醇羟基经PDC氧化后得到酮基林可霉素，然后与氨基丁酸进行缩合反应，得到四碳链羧基半抗原产物，即林可霉素半抗原；将辣根过氧化物酶标记林可霉素半抗原，制备得到酶标抗原；将林可霉素半抗原分别与BSA和OVA偶联，制备得到免疫原和包被原，进而制备得到林可霉素单克隆抗体，测得抗体效价为1:180000；将林可霉素单克隆抗体与磁珠偶联得到磁标抗体；建立了化学发光免疫检测方法，建立了林可霉素磁免疫化学发光检测试剂盒标准曲线，测得该方法对牛奶中林可霉素的检测限为5.88μg/L，该方法对林可霉素具有较高的特异性，对与林可霉素结构或者功能相似竞争的9种药物均无交叉反应。进行牛奶空白样品添加试验时回收率为85.8%～113.3%，批内变异系数为5.4%～8.6%，批间变异系数为8.4%～9.1%。该方法试剂盒配合全自动磁免疫化学发光仪检测，具有灵敏度高、特异性好、操作简单、检测时间短等优点，适合在我国政府对乳制品安全监管和企业内控工作中推广应用，为我国乳制品监管工作提供了技术支持。

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S859.79+6

A

1007-1733(2015)11-0006-04

2015-03-31）

国家重大科学仪器设备开发专项(2013YQ14037105)

*通讯作者