拟除虫菊酯类农药半抗原合成及酶联免疫分析

胡久平，李相前，任世英，周礼红

摘要：酶联免疫分析（ELISA）是农药残留检测的一种重要方法，具有方便快速、特异灵敏等优点。主要介绍了拟除虫菊酯类农药半抗原的合成方法，对拟除虫菊酯分子的环丙烷、氰基和芳香环进行修饰；对拟除虫菊酯水解产物进行修饰；增加一个连接臂作为半抗原。同时介绍了酶联免疫分析的研究进展，对拟除虫菊酯类农药半抗原的合成及酶联免疫分析进行了讨论和展望。酶联免疫分析在拟除虫菊酯类农药的残留检测中将起到越来越重要的作用。

关键词：拟除虫菊酯；半抗原；酶联免疫分析（ELISA）

中图分类号：S482.3；Q503 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）05-0993-04

Hapten Synthesis and ELISA Analysis of Pyrethroid Pesticides

HU Jiu-ping1，2，LI Xiang-qian1，3，REN Shi-ying1，3，ZHOU Li-hong2

（1.Huaiyin Institute of Technology， Huaian 223003，Jiangsu，China；2.College of Life Science， Guizhou University，Guiyang 550025，China；

3. Huaian High-Tech Research Institute， Nanjing University，Huaian 223003， Jiangsu， China）

Abstract： A enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） is an important method to detect the residue of pesticides with the characteristics of convenience and high efficiency. The main synthesis methods of hapten include modifying the cyclopropane， cyanogroup and aromatic nucleus of the pyrethroid insecticides， modifying the hydrolysate of the pyrethroid insecticides or adding a linker arm. Research progress in ELISA analysis was reviewed， and the methods of hapten synthesis and the application of ELISA were discussed. ELISA will be a promising method and play more and more important role in detecting the residue of pyrethroid insecticides.

Key words： pyrethroid； hapten； enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）

拟除虫菊酯类农药是一类重要的合成型杀虫剂[1]，它具有高效、低毒、低残留等特点，如今被广泛用于农业、林业、公共卫生等方面。但随着拟除虫菊酯类农药的大量使用，其残留对环境和人类健康造成的危害，特别是在农产品和食品中的残留问题不断引起全社会的关注[2]。如今对于拟除虫菊酯残留的分析检测多以高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-电子捕获法（GC-ECD）以及气相色谱-质谱（GC-MS）等仪器分析的方法为主。虽然这些方法检测灵敏度高，但样品的前处理步骤多且检测费用高，不适用于现场快速检测。这些问题促使人们不得不寻找一种新的快速检测方法。20世纪80年代以来，免疫学技术在农药残留检测中的应用不断深入，其中酶联免疫分析（ELISA）技术是检测农药残留较好的方法，它提供了一种对痕量残留快速、灵敏、选择性的检测方法。酶联免疫的关键技术是半抗原的设计、合成和抗体制备[3]。

1 半抗原的合成

拟除虫菊酯类农药多是相对分子质量小于1 000的化合物，其本身不具有诱导产生抗体的能力。且拟除虫菊酯分子也往往不能直接与双功能交联剂或蛋白质共价偶联，因此需要先通过化学反应在拟除虫菊酯分子上引入活性基团由此合成半抗原再与蛋白质偶联得到抗体[4]。目前半抗原的设计及合成主要有以下几种途径。

1.1 对拟除虫菊酯上活性位点的修饰

1.1.1 对拟除虫菊酯环丙烷的修饰 Lee等[5]和程敬丽等[6]将环丙烷上的双键转变为含羧基的酰胺制得半抗原（图1）；祝金凤[7]将环丙烷所连接的双键通过高锰酸钾氧化为羧基获得半抗原；Mark等[8]用臭氧将连接在环丙烷上的双键氧化为羧基和醛基；程敬丽等[9]用三氯化钌和高碘酸钠也将环丙烷上连接的双键氧化为羧基得到半抗原，且收率较高。

1.1.2 对活性基团氰基的转化 王鸣华等[10]将溴氰菊酯中的氰基转化为羧基和含羧基的酰胺达到制备半抗原的目的；张献忠[11]用合成的方式制备溴氰菊酯并将其氰基转化为羧基获得半抗原；Lee等[5]将氰基转化为羧基再与γ-氨基丁酸反应得到含羧基的酰胺半抗原（图2）。

1.1.3 在拟除虫菊酯芳香环上的修饰 拟除虫菊酯的芳香环上也存在着进行修饰的理想位点。早在1998年Queffelec等[12]就在溴氰菊酯的芳香环上引入羰基酸来制备半抗原，其具有良好特异性，且与其他拟除虫菊酯类没有交叉反应。Lee等[13]用SnCl2将芳香环上的硝基还原为氨基，其衍生物作为半抗原所得抗体对溴氰菊酯检测效果较好。罗世能等[14]在氯氟菊酯的芳香环上通过硝化、还原得到具有氨基活性基团的半抗原。孔晔等[15]将芳香环末端含硝基的溴氰菊酯的硝基还原后与丁二酸酐反应，得到芳香化末端含有羧基的酰胺半抗原（图3）。

1.2 对拟除虫菊酯菊酸部分的改造

拟除虫菊酯作为一个酯类化合物，研究表明对其菊酸部分进行改造也可以得到半抗原。李培武等[16，17]直接通过酯交换反应将菊酸替换，并对酯交换后得到的产物进行修饰制得半抗原。此类半抗原制备出的抗体对拟除虫菊酯类农药具有较高识别特异性且其制备的拟除虫菊酯类多克隆抗体效价非常高（图4）；李莹莹等[18]用γ-氨基丁酸与酰氯化的PBA进行反应从而达到替换菊酸的目的，制得PBA-GABA半抗原并成功合成了拟除虫菊酯的人工抗原（图4）。王俊平等[19]用γ-氨基丁酸与PBA进行反应得到与李莹莹等[18]所制得的相同的半抗原，但其使用的方法和试剂相对更简单。郝晓蕾[20]用酸酐取代菊酸部分得到含羧基的半抗原。

1.3 以拟除虫菊酯水解后的酸和醇的衍生物为半抗原

拟除虫菊酯水解后得到酸和醇，其衍生物也可以作为半抗原。早在1998年Anne-Laurence等[21]就对菊酸进行修饰得到了含γ-氨基丁酸的衍生物作为拟除虫菊酯类农药半抗原（图5）。还有水解得到醇的衍生物，如1997年Anatoliy等[22]对水解得到的醇进行氧化得到酸作为半抗原。虽然制备这类半抗原较为简单，但其制备的抗体特异性较差，多用于检测农药在哺乳动物体内的代谢产物。

2 酶联免疫分析技术研究进展

酶联免疫分析技术用于拟除虫菊酯类农药免疫分析已研究了多年且取得了一定的成果（表1）[4]。

根据拟除虫菊酯类农药杀虫机理不同，此类农药被划分为两类，即Ⅰ型和Ⅱ型拟除虫菊酯类农药。Ⅰ型拟除虫菊酯类农药不含氰基，相对应含有氰基的则为Ⅱ型，其结构式如图6。

2.1 Ⅰ型拟除虫菊酯的ELISA研究

2001年Takaho 等[23]利用氯菊酯衍生物和间苯氧基甲酸反应产物与甲状腺球蛋白结合形成免疫原免疫兔子。经条件优化后，氯菊酯的IC50为30.0 μg/L，对苯醚菊酯的IC50为20.0 μg/L。

Ahn等[24]用ELISA检测氯菊酯在人体内的残留，以其代谢产物DCCA-glycine为检测目标，结果反式DCCA-glycine的IC50为1.3～2.2 μg/L，顺式DCCA-glycine的IC50为0.4～2.8 μg/L。

2.2 Ⅱ型拟除虫菊酯的ELISA研究

Sally等[25]利用菊酸和间苯氧基苄醇反应制备半抗原后与甲状腺球蛋白结合免疫原免疫动物制得多克隆抗体，并且进行条件优化，经优化的ELISA方法对各种拟除虫类农药的IC50氯氰菊酯为78 ng/mL，对百树菊酯为205 ng/mL，对氨氟氰菊酯为120 ng/mL，对溴氰菊酯为13 ng/mL，对埃死菊酯为6 ng/mL，对氰戊菊酯为8 ng/mL，对氟胺氰菊酯为123 ng/mL。

Gao等[26]通过ELISA检测功夫菊酯，其IC50为37.2 μg/L，最低检测限为4.7 μg/L，与溴氰菊酯等的交叉反应弱。

3 讨论与展望

半抗原的立体化学决定免疫分析的特异性[27]，因此在半抗原合成中需要保留原化合物的分子立体结构。在合成半抗原的时候一定长度和结构的连接臂可以增大半抗原的相对分子质量和空间构型，有利于刺激机体产生抗体。但并不是连接臂越长越大越好。Freia[28]认为连接臂以C3-6为宜，但也有研究者持不同的观点。

在酶联免疫分析中抗体结构和抗原结构相似的化学物质可被用来制备某一类有分子结构共性的通用抗体。国内外对拟除虫菊酯类农药的通用性抗体研究不多，国内仅南京农业大学的骆爱兰等[29]和江苏农业科学院的李志茹[30]以间苯氧基甲酸为半抗原制备了拟除虫菊酯的通用抗体，但如何进行实际检测应用还有待进一步研究。

拟除虫菊酯类半抗原合成一直是酶联免疫检测的一个关键步骤，20世纪90年代以来小分子化合物免疫化学的理论和技术飞速发展，为人们从不同途径设计合成半抗原提供了支持；在化学合成方面发现各种新型催化剂使合成中的目标产物产率不断提高而副产物不断减少；分离纯化方面的技术也不断提高；新的能有效得到半抗原的方法也将不断出现，合成通用性半抗原也是可能的。酶联免疫分析技术在农药检测上的应用在国内起步比较晚，但因其方便、快速、灵敏等优势倍受人们的重视。酶联免疫分析技术在农药残留和食品安全等诸多方面都具有广阔的应用前景。

参考文献：

[1] 王鸣华.拟除虫菊酯化学[M].北京：中国农业科学技术出版社，2004.1-22.

[2] SCHIMMEL S C， GARNAS R L， PATRICK J M， et al. Acute toxicity， biocomcentration and persistence of AC222，705， benthiocarb， chlorpyrifos， fenvalerate， methyl parathion and permethrin in estuarine envionment[J]. J Agric Food Chem，1983（31）：104-113.

[3] 刘廷凤，杨敏娜，刘亚子，等.菊酯类农药酶联免疫吸附测定研究进展[J].环境科学与技术，2006，29（4）：100-102.

[4] 卢希勤，王鸣华.拟除虫菊酯类农药半抗原合成及酶联免疫分析研究进展[J].农药，2007，46（10）：653-655.

[5] LEE N J， MCADAM D P， SKERRITT J H. Development of immunoassays for type Ⅱ synthetic pyrethroids hapten design and application to heterologous and homologous assay[J]. J Agric Chem， 1998，46（2）：520-534.

[6] 程敬丽，赵金浩，王春梅，等.一种拟除虫菊酯类半抗原化合物的合成方法[P].中国专利：CN 101215247，2008-07-09.

[7] 祝金凤.Ⅱ型菊酯类农药广谱特异性抗体的制备和多残留免疫技术建立[D].江苏扬州：扬州大学，2008.

[8] MARK S K， SHAN G M， LEE H J， et al. Development of a class selective immunoassay for the type Ⅱ pyrethroid insecticides[J]. Analytica Chemica Acta， 2005，534（1）：109-120.

[9] 程敬丽，徐旭辉，赵金浩，等.一种高特异性拟除虫菊酯类半抗原化合物的制备方法[P].中国专利：CN 101412684， 2009-04-22.

[10] 王鸣华，施海燕，张帮红.溴氰菊酯抗原、抗体及其应用[P].中国专利：CN 101412674，2009-04-22.

[11] 张献忠.溴氰菊酯农药残留免疫检测技术研究[D].北京：中国农业科学院，2008.

[12] QUEFFELEC A L， NODET P， JAELTERS J P， et al. Hapten sunthsis for a monoclonal antibody based elisa for deltamethrin[J]. Agric Food Chem，1998，46（4）：1670-1676.

[13] LEE H J， SHAN G M， WATANABE T， et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the pyrethroid deltamethrin[J]. J Agric Food Chem， 2002，50（20）：5526-5532.

[14] 罗世能，桑光明，林建国，等.一种氯氟氰菊酯人工抗原及其合成方法[P].中国专利：CN 101519364，2009-09-02.

[15] 孔 晔，李培武，张 奇，等.一种新型溴氰菊酯农药半抗原的合成及应用效果[J].化学试剂，2009，31（4）：245-249.

[16] 李培武，张 奇，张 文，等.一种拟除虫菊酯类农药人工抗原、抗体及其制备方法[P].中国专利：CN 101434625，2009-05-20.

[17] 李培武，张 奇，张 文，等.Ⅱ型拟除虫菊酯类通用半抗原化合物及其合成方法[P].中国专利：CN 101407474，2009-04-15.

[18] 李莹莹，苗 虹， 骆鹏杰，等.拟除虫菊酯类农药人工抗原的合成与鉴定[J].中国食品卫生杂志，2011，23（3）：200-204.

[19] 王俊平，余桂春，刘 冰，等.拟除虫菊酯类农药通用人工抗原的合成与鉴定[J].现代食品科技，2011，27（5）：524-527.

[20] 郝晓蕾.含氰基拟除虫菊酯类农药多残留免疫检测方法的研究[D].江苏无锡：江南大学，2009.

[21] ANNE-LAURENCE Q， PATRICE N， JEAN-PIERRE H， et al. Hapten synthsis for a monoclonal antibody based ELISA for deltamethrin[J]. J Agric and Food Chemistry，1998，46（4）：1670-1676.

[22] ANATOLIY V Z， BORIS B D， JANNA N T. Homogeneous enzyme immuoassay for pyrethroid pesticides and their dericatives using bacillary alpha-amylase as label[J]. Analytica Chimica Acta1，1997，347（1-2）：131-138.

[23] TAKAHO W，SHAN G， DDONALD W S， et al. Development of a class-special immunoassay for the type Ⅰ pyrethroid insecticides[J].Analytica Chimiaca Acta，2001，444（1）：119-129.

[24] AHN K C，WATANABE T，SHIRLEY J G，et al.Hapten and antibody production for a sensitive immunoassay dtermining a human urinary metbolite of the pyrethroid insecticide permethrin[J].J Agric Food Chem，2004，52（15）：4583-4594.

[25] SALLY K M，GUOMIN S，HU-JANG L，et al.Development of a class selective immunoassay for the type Ⅱ pyrethriod insecticides[J].Analytica Chimica Acta，2005，534（1）：109-120.

[26] GAO H， LING Y， XU T， et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the pyrethroid insecticide cyhalothrin[J]. J Afric Food Chem，2006，54（15）：5284-5291.

[27] SKERRITT J H， LEE N. American Chemical Society[M]. Washington D C： Johns Hopkins University Press，1996.124-149.

[28] FREIA J. Detection of pesticides residues by enzyme immunoassay[J]. Pestic Sci，1989，26（3）：303-307.

[29] 骆爱兰，余向阳，张存政，等.拟除虫菊酯类农药多残留酶免疫分析方法的建立[J].中国农业科学，2005，38（2）：308-312.

[30] 李志茹.拟除虫菊酯类农药通用抗体制备及高效氟氯氰菊酯免疫检测技术研究[D].南京：南京农业大学，2004.