杀菌剂半抗原的合成及其免疫分析技术的研究进展①

曹啸天 陈秀金 李兆周 仇彩霞 郭金英 王 耀

(河南科技大学食品与生物工程学院，洛阳 471000)

在现代农业生产中，人们倾向于使用一些有保护植物作用的杀菌剂来提高作物产量，降低生产成本。然而，有些生产者由于受利益驱使长期滥用杀菌剂，造成了农产品中的杀菌剂残留超标。研究表明：多种杀菌剂的低浓度残留可能会对人类和其他动物造成不良后果，甚至诱发癌症[1]。因此，需要严格控制农产品中的杀菌剂残留量。为了更好地保障农产品的安全和消费者的利益，欧盟对农产品中杀菌剂的最大残留限量进行了规定，如水果中杀菌剂的最大残留限量0.05 mg/kg；谷物中杀菌剂的最大残留限量0.01 mg/kg；蔬菜中杀菌剂的最大残留限量0.05 mg/kg；坚果中杀菌剂的最大残留限量0.05 mg/kg[2]。我国对农产品中杀菌剂最大残留限量进行了限定，如水果中不同杀菌剂的最大残留限量0.1～15 mg/kg；谷物中杀菌剂最大残留限量为0.01～5 mg/kg；蔬菜中杀菌剂的最大残留限量0.05～10 mg/kg；坚果中杀菌剂的最大残留限量0.01～0.3 mg/kg[3]。

目前，气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-串联质谱法和高效液相色谱-串联质谱法[4-13]等仪器分析法已广泛用于杀菌剂残留检测，这些方法灵敏度高、准确性好，但需要昂贵的仪器、专业的操作人员、大量的有机溶剂和繁琐的样品前处理，无法满足现场检测需求[14]。而免疫分析技术正好可以弥补上述不足，具有简单快速、经济实用、灵敏度高和特异性强的优点[15]。本文对用于杀菌剂检测的免疫分析法和仪器分析法进行比较[16]，结果见表1。

表1 免疫分析法和仪器分析法的比较Tab.1 Comparison of immunoassays and instrumental methods

免疫分析技术的灵敏度主要取决于抗体的质量，而半抗原的设计和合成对抗体质量好坏起到决定性作用。因此，本文对杀菌剂半抗原的合成及免疫分析技术在杀菌剂残留检测中的应用进行综述。

1 杀菌剂半抗原的合成

半抗原的设计要求既要尽可能保留分析物的化学结构，还要尽量减少对分析物的空间构象和电荷分布的影响。下面按照杀菌剂种类不同分别对半抗原合成进行介绍。

1.1三唑类杀菌剂半抗原的合成 三唑类杀菌剂是目前生产上广泛应用的一类杀菌剂，具有广谱、高效和内吸性强等优点[17]，其共同结构是主碳链上含有羟基(或酮基)、取代苯基和1，2，4-三唑基，其半抗原的合成途径有5种，一是对三唑类杀菌剂分子中的羰基(或羟基)进行修饰，如Newsome等[18]通过还原分子中的羰基得到羟基，然后与琥珀酸酐反应得到三唑酮的半抗原。Jiang等[19]在烯唑醇分子的羟基上引入四碳间隔臂，合成相应的半抗原。Cao等[20]用4-溴甲基-苯甲酸把多效唑分子上的羟基氧化为羧基，获得相应的半抗原。王明明等[21]采用琥珀酸酐和多效唑分子上的羟基进行反应，合成了多效唑的半抗原。二是对三唑类杀菌剂分子中的氰基进行修饰，如Székács等[22]将腈菌唑分子中的氰基水解成氨基得到相应的半抗原。三是对三唑类杀菌剂苯环上的氯原子进行取代，如Danks等[23]采用羟基和氨基分别取代戊唑醇苯环上的氯原子合成了戊唑醇的半抗原1和半抗原2，四是利用三唑类杀菌剂的代谢物为原料合成半抗原，Forlani等[24]以氟醚唑的代谢物为原料合成半抗原。五是利用从头合成途径合成半抗原；Liu等[25]采用1-氯-3-(4-氯苯氧基)苯为原料，合成了苯醚甲环唑的两种半抗原。其中半抗原1的结构含有苯醚甲环唑的部分结构，而半抗原2的结构含有苯醚甲环唑的完整结构。

1.2酰苯胺类杀菌剂半抗原的合成 酰苯胺类杀菌剂是一类内吸传导性杀菌剂，其中大多数品种对卵菌纲病害有优异的防效。酰苯胺类杀菌剂半抗原的合成途径有3种：一是通过水解杀菌剂制备半抗原，如研究者Rosso[26]和Newsome[27]分别通过水解苯霜灵和甲霜灵分子中的甲基得到苯霜灵和甲霜灵的半抗原；二是利用从头合成途径合成半抗原，如刘蓉蓉等[28]从头合成了菌核净的半抗原戊二酸半酯；三是以杀菌剂为原料进行衍生，如Watanabe[29]等直接对氟酰胺分子的甲基末端进行衍生得到羧基，合成了氟酰胺半抗原。

1.3酰亚胺类杀菌剂半抗原的合成 酰亚胺类杀菌剂是含有酰亚胺结构的有机化合物，用于杀灭种子上病原菌和叶面病原菌。酰亚胺类杀菌剂半抗原的合成途径有2种：一是通过置换杀菌剂苯环上的氯原子制备半抗原，如Liu等[30]用6-氨基己酸取代百菌清分子苯环上的氯原子得到百菌清的半抗原。二是利用目标物的结构类似物为原料合成半抗原，如王松等[31]利用四氢邻苯二甲酰亚胺和邻苯二甲酰亚胺为原料，分别与5-溴戊酸发生取代反应，得到克菌丹的半抗原。

1.4苯胺基嘧啶类杀菌剂半抗原的合成 苯胺基嘧啶类杀菌剂具有高效性和低毒性的优点，对灰葡萄孢所致的各种病害有特效。其半抗原的合成途径有3种情况：一是以杀菌剂为原料合成半抗原，如Esteve等[32]以嘧菌胺为原料，经过两步反应合成半抗原1，同时以1-碘-3-硝基苯和2，4-二氯-6-甲基嘧啶为原料合成半抗原2。二是以杀菌剂结构类似物为原料合成半抗原。如姜震等[33]以2-氯-4,6-二甲基嘧啶和4-硝基苯胺为起始原料，经过3步反应得到的产物与琥珀酸酐反应，在分子中引入羧基得到嘧霉胺的半抗原。三是利用从头合成途径合成半抗原，如Esteve等[34]从头合成了2种半抗原。

1.5其他类杀菌剂半抗原的合成 Mercader等[35,36]研究了醚菌酯和肟菌酯为原料，经碱水解合成了两种半抗原。Mercader等[37]设计了氟唑菌酰胺的2种半抗原，半抗原1是以3-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯为原料，经过6步反应，用间隔臂取代目标物吡唑环上的甲基获得的；半抗原2是以氟唑菌酰胺为原料经过5步反应，用六碳羧基手臂取代目标物吡唑环上的二氟甲基获得的。Ceballos等[38]制备了2种含有羧基活性基团的半抗原，分别是用五碳羧化脂肪族直链取代吡唑N-甲基基团制成的和是用间隔臂取代了噻吩环邻位上的支链4-甲基戊-2-基取代基制成的。李潇潇[39]等以噻呋酰胺分子部分结构2-甲基-4-三氟甲基-5-噻唑甲酸作为半抗原。

2 免疫分析技术

2.1ELSA ELISA作为一种快速检测大量样品的方法，被成功地用于杀菌剂残留的检测。本文总结了检测杀菌剂残留的抗体类型、半数抑制浓度和ELISA的检测限见表2。

由表2可知，近十年来，国内外研究者主要应用单克隆抗体建立了检测杀菌剂残留的ELSA方法，方法的IC50均低于19.6 μg/ml,最低检测限达到了0.01 ng/ml，远远低于欧盟和我国规定农产品中杀菌剂的最大残留限量。对杀菌剂残留的检测样品不仅有水果、蔬菜和谷物，还包括了环境土样和水样，添加回收率范围在70%-130%。这些研究表明，ELISA已经广泛用于杀菌剂残留的检测。从表2还可以得出，目前研究者建立单一杀菌剂残留检测的ELISA比较多，关于杀菌剂多残留检测的ELISA比较少，但是农产品中往往是多种杀菌剂同时残留，由此将来需要研究对多种杀菌剂残留同时检测的ELISA。

表2 ELISA用于检测杀菌剂残留Tab.2 ELISA for detection of fungicide residues

2.2免疫层析法 免疫层析法(immunochromato-graphy assay，ICA)是20世纪80年代初发展起来的一种涵盖了免疫分析、标记和层析的综合科学技术，根据示踪标记物将ICA分为量子点免疫层析法、胶体金免疫层析法(gold immunochromatography assay,GICA)等。所谓量子点ICA是以量子点为标记物的ICA，已用于戊唑醇的检测。如Wang等[63]开发了基于量子点珠的荧光免疫层析试纸条，用于快速灵敏地检测农产品中的戊唑醇残留，检测限为0.02 ng/ml。GICA是以金纳米粒子为标记物的免疫层析法，已广泛地用于杀菌剂的快检。如Luo等[64]采用应对苹果中的异菌脲进行检测，检测限为25 ng/ml。Yang等[65]运用EICA试纸条对黄瓜中的百菌清残留进行检测，消线值小于100 ng/ml，使用读卡器定量检测时，检测限为91.78 ng/ml。袁宝凤等[66]对比了甲霜灵和吡虫啉杀菌剂试纸条和色谱法的检测结果。表明甲霜灵胶体金试纸检测结果与色谱仪检测结果具有很好的相关性。楼小华等[67]采用EICA对烟叶中三唑酮和三唑醇残留量进行快速检测，检测限为1 mg/kg。Xing等[68]应用ICA检测饮用水中的百菌清残留，消线值为5 ng/ml。由于GICA具有快速、简单、便携性强、可用于现场检测等显著优点，将会受到越来越多的关注[69]。

2.3时间分辨荧光免疫分析法 时间分辨荧光免疫分析方法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是以具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合剂作为示踪物，建立的一种新型的非放射性微量分析技术。该方法也已开始用于杀菌剂残留的分析检测。例如王明明等[21]建立了检测多效唑的TRFIA法，线性检测范围是0.067-23.05 ng/ml，IC50为1.09 ng/ml，检测限为0.012 ng/ml，同ELISA相比，灵敏度提高了19.6倍。Sheng等[70]以铕(Eu3+)和钐(SM3+)作为荧光标记物，研制了一种高灵敏度的双标TRFIA，用于检测食品中的噻虫胺和烯唑醇。在优化后的条件下，得到噻虫胺的IC50和检测限分别为5.08 ng/ml和0.021 ng/ml，烯唑醇的IC50和检测限分别为13.14 ng/ml和0.029 ng/ml。与传统的ELISA相比，TRFIA法的灵敏度更高，稳定性更好，动态范围更宽，试剂保存期更长，无放射性危害，在国际上被公认为现代标记免疫的最佳方法之一[71]。

2.4免疫传感器 免疫传感器(immunosensor，IA)是基于抗原抗体特异性识别功能而研制成的一类生物传感器，现已应用于杀菌剂残留的检测。如Hirakawa等[72]利用IA对蔬菜中的百菌清残留量进行检测，定量检测范围为8.0～44 ng/ml，IC50为25 ng/ml。另外，Mauriz等[73]应用表面等离子共振IA对果汁中吡唑菌胺酯进行分析，方法的检测限低至15 ng/ml，在蔬菜中的回收率75%～90%。Hirakawa等[74]也研制了检测蔬菜中啶酰菌胺的表面等离子体共振IA，方法检测限为15～93 ng/ml。IA缩短了分析时间，提高了方法的灵敏度和测试精准度，也简化了测定过程，易于实现自动化，具有广阔的应用前景。

3 存在问题与展望

3.1半抗原的设计 目标物半抗原分子设计的合理性是免疫分析方法中抗体制备的关键。然而，大部分杀菌剂中原本的设计是通过反复的动物免疫试验来验证，具有很大的盲目性。近十年来，免疫学家正尝试通过引入分子模拟技术，预测半抗原设计的可行性，大大提高了半抗原设计的科学性。

3.2免疫试剂的稳定性 近年来，免疫产品的应用与开发受到抗体稳定性的制约。一方面，新型小分子抗体的发展，可以在一定程度上解决抗体试剂的稳定性。如纳米抗体因具有较好的耐热稳定性和耐有机溶剂的性质，可以更好地用于免疫产品的开发。另外，研究者利用分子印迹技术制备仿生抗体也能够很好地弥补生物抗体的稳定性不足，促进免疫分析的发展。

综上所述，分子模拟技术的引入、新型小分子抗体和仿生抗体的研究和发展，能够较好地解决免疫分析技术应用时存在的问题。另外，近年来还出现了免疫分析方法和纳米材料(荧光纳米材料)的结合，不仅可以提高免疫分析方法的灵敏度，还可以拓宽方法的检测范围。因此，随着免疫分析技术和其他技术的不断结合和发展，检测分析技术将会朝着绿色、快速、多残留、高灵敏、低成本和商品化的方向发展，将会在杀菌剂残留检测中发挥着越来越重要的作用。