一株高产脂肪酶菌株选育及其酶学性质的研究

周秀军 周利芳 周建民 隋喜龙 （威海天智皮毛制品有限公司 山东 文登 264400）

试验研究

一株高产脂肪酶菌株选育及其酶学性质的研究

周秀军 周利芳 周建民 隋喜龙 （威海天智皮毛制品有限公司 山东 文登 264400）

本研究对不同地点采集的可能含产脂肪酶菌的土壤样本进行筛选和菌种鉴定，分离得到其中产脂肪酶的菌株，通过紫外-光复活诱变选育提高产量。选择稳定的菌株进行酶的分离纯化，并且对部分酶特性及载体进行研究。结果表明，从土壤中筛得脂肪酶产量为29.6U/ml的菌株，通过紫外-光复活诱变产量提高72%。酶学性质研究显示固化后酶的转脂率远高于工业用酶的转脂率。

脂肪酶 菌株 选育 酶学性质

脂肪酶是一类重要的的水解酶[1]，它是能够催化油脂降解为脂肪酸、甘油或其他长链脂肪酸的催化剂[2]，脂肪酶在动植物体内及微生物中[3-4]广泛存在。因脂肪酶可以分解油脂，因此被广泛应用在皮革加工、食品医药及合成多肽等领域。因此，获得产脂肪酶高的菌株在未来发展中存在巨大的应用价值。近年来有研究发现可通过紫外-光复活诱变得到正突变率高的菌株，进而得到产脂肪酶突变高的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的来源 从长期受油污覆盖的油烟机排气孔、或富含营养的排污池及下水道土壤等取得约30份土样。

1.1.2 主要试验用培养基 富集培养基：橄榄油10ml、酵母粉0.2g、Na2HPO43.5g、KH2PO41.5g、MgSO40.5g、NH4NO35g、NaCl0.5g、加入微量金属离子，调整pH7.5加入蒸馏水定容至1000ml，121℃高压20min。细菌分离用培养基：牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl5g、琼脂20g、橄榄油20ml，加入微量金属离子等，0.2%维多利亚蓝B 3ml，调整pH7.5用蒸馏水定容至1000ml，115℃高压灭菌20min。种子培养基：蛋白胨2.5g，葡萄糖2.0g，橄榄油1.0ml，KH2PO40.1g、MgSO40.05g、NH4NO30.5g、调整pH7.0，用蒸馏水定容至100ml，115℃灭菌20min。发酵培养基：蛋白胨20g，蔗糖5g，橄榄油10ml，NH4Cl 1g，K2HPO4·3H2O 2g，MgSO40.50g，NaCl 0.5g，用蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌15min。

1.1.3 主要试剂 DNAzol Regent购自Invitrogen公司；RNAiso Plus、Reverse transcriptase XL(AMV)、Ribonuclease Inhibitor、dNTP、rTaq DNA polymerase、DNA Marker(DL2000)、RNase-free水、胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；核酸染料购自北京SBS公司；大孔树脂HPD600购自于沧州宝恩吸附材料科技有限公司；琼脂糖购自西班牙Biowest公司。

1.2 方法

1.2.1 高产脂肪酶菌株的分离与鉴定 取1ml水样((或称取1g土样)，加入10ml经过高压灭菌的蒸馏水中，混匀后按1:10接种到富集培养基中，30℃、低速振荡培养48h后，将菌液进行10倍系列梯度稀释，取10-4、10-5、10-6三个梯稀释度均匀涂抹于初筛罗丹明B平板，30℃培养，观察菌落的生长状态及变色圈的情况。挑取有变色圈的菌落纯化分离，将纯化后的单菌落在种子液中长到对数期后进行培养96h，发酵液高速离心10min，吸取发酵液上清，检测上清中的脂肪酶活力。

1.2.2 脂肪酶酶活测定 利用对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)分光光度比色法[6-7]，测定初始水解酶活。

1.2.3 产脂肪酶菌株的鉴定 通过革兰氏染色的方法、穿刺培养试验等进行菌株的形态观察，选择4、20、28、37、41℃观察细菌生长情况，确定最适温度。提取细菌总DNA，用通用引物进行扩增，获得目的片段后进行测序。

1.2.4 紫外-光复活诱变 参考文献8中菌株的诱变的方法，对菌株进行诱变筛选，从诱变获得的菌株中挑选出脂肪酶最高产量的菌株进行传代，进行菌株产酶遗传稳定性检测。

1.2.5 脂肪酶的纯化 选用报道的方法进行脂肪酶的发酵[9]。硫酸铵沉淀进行脂肪酶的收集，冰浴3～4h。离心，收集沉淀，进行透析脱盐。将已透析脱盐的粗酶液进行高速离心，吸取上清，加到经过平衡的阴离子交换柱(2.0cm×20cm)上，200ml 0～1mol/L的NaCl线性梯度洗脱。平板定性检测脂肪酶活性，收集有酶活性溶液，进行冻干。采用Bradford 法进行测定，以牛血清白蛋白为标准蛋白进行蛋白质浓度的测定。

1.2.6 酶学性质的研究 （1）脂肪酶分子量大小、纯度及活性的测定：通过常规的聚丙烯凝胶电泳的方法检测试验所获得的脂肪酶分子量大小，通过高分离度液相色谱的方法进行纯化的脂肪酶的纯度检测，通过滴定法进行脂肪酶活性测定。（2）酶学性质的研究：将酶置于20、30、35、40、45、50、60、70℃下，以未经过处理的酶的酶活为对照，计算相对酶活；选取pH分别为3、35.、4、4.5、5、5.5、6、6.7、7、7.5、8、8.5、9、10的缓冲液测定不同pH下脂肪酶的酶活。（3）脂肪酶固定及转脂率的测定：用95%的酒精浸泡大孔树脂24h，用超纯水进行反复冲洗后抽滤，依次经过酸浸泡2h，反复冲洗，碱浸泡2h，反复冲洗，每次冲洗均需冲洗为中性。最后浸于pH为7的磷酸钠缓冲液(pH7)中。将诱变以后可稳定生长的菌株TZ-05脂肪酶进行发酵纯化后进行固定，然后再研究其转酯特性，采用考马斯亮蓝法测定发酵液上清的蛋白含量。选用橄榄油为底物，采用无溶剂转酯体系，将底物20ml，依次加入10ml水、3.32ml甲醇，与固化脂肪酶进行混合反应，反应条件为30℃、160 r/min，4h后取反应液10000rpm离心5min，吸取上清稀释150倍后进行气相色谱实验，计算转酯率。

2 结果

2.1 菌株

分离筛选出10株能在初筛培养基中生长、有罗丹明B反应的细菌。筛选获得的大部分菌株初始所产脂肪酶酶活很低，酶活情况具体见表1，只有土壤样品中筛选获得的菌株TZ-05株的初始酶活较高，远高于试验其他菌株，可达到29.6U/ml，因此选择菌株TZ-05作为试验菌，菌株TZ-05在罗丹明B筛选平板生长，可以生成的水解圈(图1)。

表1 筛选菌株初始酶活结果

图1 罗丹明B筛选平板上生成的水解圈；菌株TZ-05的菌落形态；革兰氏染色观察

2.2 高产脂肪酶菌株TZ-05

菌株TZ-05在LB固体培养基上，30℃下划线生长24h后，发现菌落呈圆形，形态较小，菌落颜色为浅黄色，不透明，表面光滑，边缘整齐，周围培养基没有晕染。取菌落进行革兰氏染色，镜下观察生长的菌株为G-细菌，细菌形态为短杆状(图1)。穿刺试验显示细菌能运动。对菌株TZ-05 16SrRNA分子生物学鉴定结果显示获得约1500bp片段的特异性条带，与预期试验结果相符；进化树分析显示，与伯克霍尔德菌同源性最高。

2.3 紫外-光复活诱变剂量

2.3.1 紫外照射结果 用紫外灯分别照射30、40、50、 60s，计算致死率和正突变率，试验操作重复6次，计算平均值，具体计算结果见表2。由表可见，在紫外照射50s时，正突变率最大，此时致死率为90%。因此，试验选定第一次紫外照射时间为50s。

表2 第一次紫外照射结果 (s、%)

2.3.2 光复活结果 选用紫外照射50s。进行光复活试验，重复进行试验10次，计算存活率和正突变率的平均值，结果见表3。由表3可见，在光复活10s时，正突变率为14%，存活率为26%，因此试验选定光照射10s。

表3 光复活结果 (s、%)

2.3.3 第2次紫外照射结果 重新选取菌液，分别按照上述试验结果进行紫外诱变50s后光复活10s，然后进行第2次紫外诱变，重复试验10次，计算致死率和正突变率的平均值，结果见表4。由表4可见，第2次诱变20s时得正突变率20%，所以试验选定第2次诱变时间为20s。

表4 第二次紫外照射结果 (s、%)

2.3.4 重复紫外-光复活诱变结果 按照紫外诱变50s，光复活10s，紫外诱变20s，每次处理都计算致死率和正突变率的影响结果见表5，进行10次重复试验计算致死率和正突变率的平均值。确定诱变步骤为：紫外诱变的时间50s，光复活10s，第2次紫外诱变20s，按照相同的步骤对菌悬液重复处理2次。

表5 重复紫外-光复活诱变结果 (%)

2.4 菌株脂肪酶含量的稳定性

选取诱变以后产量最高的菌株，测得其比原始菌株提高72%。将得到的最高产量的菌种保存，并且对其进行连续传代、发酵培养，并对每代次菌株的产酶活力进行鉴定，具体结果见表6。由表6可见，第10代的TZ-05菌株，脂肪酶产量仍然比较稳定。

表6 菌株酶活力稳定性传代结果 (IU/ml)

2.5 脂肪酶的分离纯化

TZ-05菌株脂肪酶发酵液经过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析等步骤纯化后，脂肪酶纯化了78倍，活性回收率为35%。SDS-PAGE凝胶电泳图谱显示，纯化后的脂肪酶分子量约为35～40Kd之间，为单一目的条带。

图2 S-PAGE电泳条带

2.6 TZ-05脂肪酶活性在不同离子作用下脂肪酶活性的影响

向纯化后的TZ-05脂肪酶酶液中，分别加入终浓度为2mmol/L钙、镁、铁、锌、铜、铁等二价金属离子和EDTA，同时设未加离子的空白TZ-05脂肪酶酶液为阴性对照，TZ-05脂肪酶的活性测定结果显示，在钙离子或镁离子的作用下，脂肪酶的活力能显著提高，其中钙离子的作用效果最好，能够提高到250%。而锰铁锌等离子对TZ-05脂肪酶有显著的抑制作用，尤其是铁离子和锌离子，结果不到空白对照的二分之一，这与报道的实验结果一致[10]。结果见表7。

表7 脂肪酶活性在不同离子作用下活性测定 (%)

2.7 TZ-05脂肪酶的最适温度的确定

选取20、30、35、40、45、50、60、70℃温度下进行TZ-05肪酶酶液最适活力温度的筛选，结果显示在45℃时，酶活性最高，确定45℃为TZ-05脂肪酶的最适温度，具体结果见表8。选取30、40、45、50、55、60、70℃等温度进行脂肪酶活力稳定性的测试，结果显示在60℃以后，酶活性急剧下降，处理30min 以后，脂肪酶的活性仅为50 %。结果见表9。

表8 最适温度的选择 (℃、%)

表9 不同温度先酶活性的稳定性 (℃、%)

2.8 TZ-05脂肪酶的最适pH和pH稳定性的测定

选取pH分别为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.7、7、7.5、8、8.5、9、10的缓冲液测定脂肪酶的酶活力，结果显示pH 7.0 为TZ-05脂肪酶的最适pH。结果见表10。选取pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10的脂肪酶酶液，室温处理4h ，结果显示脂肪酶在pH2.0～pH9.0的范围内活力保存较稳定，见表11。

2.9 不同有机溶剂对TZ-05脂肪酶活性的影响

分别将甲醇、乙醇、丙醇、2-丙醇、乙酸乙酯及乙酸甲酯与脂肪酶酶液按照不同的比例混匀，25℃下处理，24h后测定脂肪酶酶活力。结果显示，醇类有机溶剂碳链越长，脂肪酶的活性就越低。

表10 最适pH的选择 (%)

表11 不同pH酶活性的稳定性 (%)

表12 不同有机溶剂对酶活性的影响 (%)

2.10 TZ-05脂肪酶对不同油脂的水解特异性

用TZ-05脂肪酶分别水解橄榄油、棉籽油、蓖麻油、菜籽油、三油酸甘油酯等不同的油脂，结果显示，脂肪酶对一般的油脂水解效果差异很小，只有蓖麻油的效果较差。

表13 不同油脂底物脂肪酶水解的特异性 (%)

2.1.1 菌株TZ-05脂肪酶的转酯特性

将TZ-05脂肪酶发酵纯化后进行固定，1h后大孔树脂HPD600载体的固定吸附率达到了95%以上，固定效果较好。以橄榄油为底物在无溶剂体系中进行转酯反应，结果表明固化酶及实验对照酶均具有较高的转酯率。并且2种酶的转脂产物较为相似，油酸甲酯得率最高，均超过50%。固化酶的转酯率为97.2%，远高于对照用工业脂肪酶LS-20的83.73%，反应产物气相色谱分析见表14所示。

表14 转酯产物的气相色谱结果

3 讨论

微生物是脂肪酶的重要来源，筛选培育水解酶活高、且酶学特性优良的产脂肪酶菌株，应用于毛皮加工的脱脂工艺中，对于提高毛皮加工的效率具有重要意义。本试验经过分离纯化，获得一株产酶量较高的脂肪酶菌，并且经过紫外诱变，将产酶量提高了72%；对脂肪酶进行分离纯化，进行酶部门性质及固化载体的研究，得到温度、有机溶剂及pH等对脂肪酶活性的影响，筛选出良好固化载体，均为以后的研究奠定了基础。

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Q556+.1

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1007-1733(2015)11-0001-04

2015-09-15）

国家星火计划(2013GA740002)。