柿属植物叶绿体DNA提取方法优化

傅建敏，梁玉琴，孙 鹏，姬燕晓 ，谭晓风

（1.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2.武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉430072； 3.中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙410004）

柿属植物叶绿体DNA提取方法优化

傅建敏1，梁玉琴1，孙 鹏1，姬燕晓2，谭晓风3

（1.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2.武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉430072； 3.中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙410004）

利用Percoll密度梯度离心法，对4种柿属植物君迁子D. lotusL.、油柿D. oleiferaCheng、浙江柿D.glaucifoliaMetc.、金枣柿D. kakispp.进行叶绿体DNA（cpDNA）提取方法的优化，结果显示优化后的柿属植物cpDNA提取方法具有高效、简便、重复性好、稳定性高的特点；经检验，利用此方法提取的cpDNA质量好，浓度与纯度均较高，能够满足后续叶绿体PCR扩增、基因组测序等分子生物学试验。

柿属植物；叶绿体；DNA提取；Percoll密度梯度离心

我国柿属植物有58个种和变种（变型），其中特有种27个，主要分布在我国西南部至东南部，其中作为果树栽培的有柿Diospyros kakiThunb、君迁子D.lotusL.、油柿D.oleiferaCheng、浙江柿D.glaucifoliaMetc.等，其中尤以柿经济价值最高，栽培范围最广[1-2]。我国是柿的分布中心和原产中心之一，拥有丰富的柿种质资源，现有品种1 000多个[3]。前人利用形态学、细胞学、生物化学和分子标记等方法在柿属植物遗传多样性、亲缘关系和种质鉴定等方面进行了研究，证实君迁子、油柿、浙江柿均属于柿近缘2倍体野生种[4-5]，但由于研究起步晚，技术水平低，加之柿属植物倍性复杂，野生资源缺失等原因，致使柿这一天然6倍体的遗传背景、起源演化进程等都没有得到统一、准确的结论，严重制约了柿遗传改良、杂交育种等工作的进行。

胞质基因组序列保守，相对于核基因组更小，但其进化速度较快，胞质基因组序列分析，特别是叶绿体基因组序列分析，在科内属间和属内种间均可进行分子系统发育研究，甚至在某些植物类群中可以进行种内遗传多样性检测[6]。并且由于其遗传为非孟德尔遗传方式，为母系遗传，对于亲本不明确的植物，可以排除父本干扰，在系统发育研究中具有独特优势，同时，其分析结果可以为核基因组研究提供佐证，使得植物系统发育重建更加准确[7]。要进行叶绿体基因组研究，分离得到叶绿体是第一步，获得高质量的cpDNA是后续各项分子生物学研究的前提[8-10]。柿属植物叶片中多糖、酚类等物质含量较高[11]，叶绿体DNA提取较为困难，目前尚未见柿属植物叶绿体DNA提取的报道。

本研究利用Pecoll密度梯度离心法，对君迁子、油柿、浙江柿、金枣柿4种柿属植物进行cpDNA提取方法优化，为后续叶绿体基因组研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

研究材料为柿属4个种：君迁子、油柿、浙江柿、金枣柿，于5月中旬在中国林科院经济林研究开发中心原阳资源圃，分别采集4个样品枝条顶端、健康无病虫害、刚展开不久的正常绿色幼嫩叶片，置于冰盒内冷藏保鲜，带回实验室备用。试验过程中每种样品都进行3次生物学重复。

1.2 试验所用试剂

缓冲液A：0.4 mol山梨醇；5 mmol EDTA；0.1 mol Hepes-NaOH(pH 7.5)；使用前加入2.5% (w/v)PEG-8000；2% (w/v) PVP-40；1% (w/v) BSA；10 mmol 抗坏血酸。

缓冲液B：0.25 mol蔗糖；10 mmol MOPS(pH 7.2)；

裂解缓冲液：100 mmol Tris-HCl，pH值8.0；50 mmol EDTA；100 mmol NaCl；1%SDS；使用前加入 20 μg/mL RNase A。

Percoll分离液梯度设置及配置见表1。

表1 Percoll分离液配置Table 1 The gradients of Percoll

1.3 方 法

1.3.1 叶绿体分离与纯化

叶绿体分离纯化所有步骤均需在4 ℃ 条件下进行，具体操作如下：

（1）取大约50 g嫩叶，加入400～500 mL预冷缓冲液A，组织研磨仪进行研磨；然后将匀浆经4层Mira滤布和2层纱布过滤，滤液分装到2个500 mL的离心瓶中。

（2）滤液1 000×g 离心5 min，上清液转入2个干净的500 mL离心管中，18 000×g 离心30 min，弃上清液留沉淀。

（3）每管中加入500 mL缓冲液B，用湿刷子小心地将沉淀物重新悬浮于溶液中，1 000×g离心5 min。

（4）移液管将上清液转入2个干净的离心管中，18 000×g 离心20 min以得到叶绿体粗提物。

（5）得到的叶绿体沉淀中加入16 mL缓冲液B，将液体分为3份，完全混匀使其悬浮，然后分别在18%、30%、60% Percoll分离液中，进行超高速密度梯度离心。

（6）40 000×g 离心60 min后，即可在管中液面中下部观察到叶绿体沉淀。

（7）将叶绿体层吸取出转移至1.5 mL的离心管中，加入2体积的缓冲液B，台式离心机4 ℃条件下，30 000×g 离心20 min，得到超纯叶绿体颗粒。

（8）将叶绿体重新置于新的离心管中，加入500 μL缓冲液B，20,000×g 离心20 min，完全去除Percoll分离液。

1.3.2 cpDNA提取与纯化

（1）将叶绿体颗粒重新悬浮于0.2～0.5 mL的缓冲液B中，200 µg/mL DNase 和10 mmol MgCl2冰浴1 h，以去除核DNA污染。

（2）冰浴结束后，加入9 mL缓冲液B（含10 mmol EDTA），18 000×g 离心20 min，促使叶绿体沉淀。

（3）裂解液重新悬浮颗粒，60 ℃ 水浴30 min，期间振荡数次。

（4）加入1/3体积预冷的5 mol乙酸钾，轻轻混匀后冰浴30 min，促使蛋白、脂类、SDS络合物沉淀，冰浴期间不时将液体振荡混匀。

（5）20 000×g 离心20 min，轻轻将上清液转移至新的离心管中，20 000×g 再次离心10 min，去除残留悬浮碎片。

（6）取上清液至一干净离心管中，加入1/2体积异丙醇，1/20体积 5 mol 乙酸铵，轻轻颠倒混匀后-20 ℃ 保存过夜。

（7）20 000×g 离心15 min，得DNA沉淀，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，弃乙醇，DNA风干 5～ 10 min。

（8）200 µL TE 缓 冲 液（50 mmol Tris、10 mmol EDTA， pH 8.0）溶解DNA，转入Microfuge离心管中，20 000×g 离心10 min，去除未溶解的细胞碎片，重新将上清液转入新的离心管中，4 ℃保存备用。

1.3.3 cpDNA检测

利用1.5%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计对所提取的cpDNA浓度与纯度进行检测，并利用通用引物对trnH-trnK基因间隔区进行PCR扩增[12]，2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，其中琼脂糖凝胶电泳上样量均为3 µL。

2 结果与分析

2.1 叶绿体的分离与纯化

图1显示3种不同浓度Percoll分离液对君迁子叶绿体的分离效果，可以看出60%的Percoll分离液分离效果最好，能够较好的将叶绿体分离开。图2为君迁子叶绿体在60%的Percoll分离液中的最终分离结果，其中A为脂质层，B为破碎细胞层，C为叶绿体层，D为杂质层，各成分分层明显，分层之间液体清晰透明，说明60%Percoll分离液分离效果好，能够将叶绿体很好的分离出来，得到较纯的叶绿体颗粒。油柿、浙江柿和金枣柿叶绿体也是在60%的Percoll分离液中分离效果最好。

图1 君迁子叶绿体在不同浓度Percoll 分离液中的分离效果Fig.1 The results of chloroplast of D.lotus in different Percoll gradients

图2 君迁子叶绿体在60%的Percoll分离液中的最终分离效果Fig.2 The fi nal isolation result of chloroplast of D.lotus in 60% Percoll

2.2 cpDNA提取

琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3，可以看出利用上述提取方法，4个样品均可得到较纯cpDNA，电泳条带清晰整齐，无杂带，无拖尾现象，点样孔中无杂质，所提取的DNA完整，纯度较高。且对比Marker中标准条带的明亮程度（500 bp条带为100 ng/µL），可知四个样品cpDNA浓度均高于100 ng/µL，其中君迁子和浙江柿DNA浓度略高于油柿和金枣柿。

图3 cpDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.3 cpDNA determined with agarose gel electrophoresis

表2为紫外分光光度计检测各样品DNA浓度及纯度，结果显示4个样品所提取的cpDNA的A260/A280值在1.90左右，说明DNA中蛋白质等大分子杂质少，纯度较高；A260/A230的值均大于2.0，说明DNA中无多糖等杂质；4个样品相对比，君迁子、浙江柿DNA纯度比油柿、金枣柿要稍微高些，但差别不大。浓度大小显示，浙江柿最高为1 210.50 ng/µL，其次为君迁子 1 139.21 ng/µL，油柿为 1 034.52 ng/µL，最低的为金枣柿 870.76 ng/µL，结果与琼脂糖凝胶电泳结果基本一致，进一步说明优化后的DNA提取方法能够有效去除柿属植物叶片中的多酚、多糖等物质，得到较高纯度的cpDNA，并且此方法适用于柿属不同植物叶片叶绿体DNA提取，方法稳定可靠。

2.3 PCR扩增检测

图4为PCR扩增结果，可以看出4个样品经过PCR扩增均能得到大小为1 500 bp左右的单一清晰目的产物，说明所提取的DNA为叶绿体DNA，质量较好纯度较高，能够满足后续分子生物学试验，电泳图中可以预测4个样品叶绿体基因组中trnH-trnK片段长度大小略有不同，此区域序列可能存在小片段的插入或缺失，具体情况可通过后续基因组测序进行验证。

表2 DNA紫外分光光度计检测结果Table 2 The results of ultraviolet spectrophotometer

图4 PCR扩增产物检测结果Fig.4 PCR ampli fi cation results

3 结论与讨论

高盐低pH法是分离提取植物cpDNA的有效方法[13-15]，但是与之相比，Percoll密度梯度离心法具有快速、高效的优点[16]。有效分离叶绿体颗粒，避免细胞核、线粒体等污染，是叶绿体DNA提取的关键，本研究利用60%浓度的Percoll分离液对叶绿体进行分离，同时结合密度梯度离心法，能够有效去除细胞核、线粒体及细胞碎片等，得到较纯叶绿体，方法简单易行。柿属植物叶片中富含黄酮、单宁等多酚类物质[17]，在DNA提取过程中容易氧化，对DNA提取造成一定困难，本试验提取缓冲液中加入PVP、抗坏血酸等试剂，能够有效防止多酚氧化，确保DNA提取质量，检测结果显示所提取的DNA完整，杂质少纯度高，能够满足后续PCR扩增、基因组测序等分子生物学试验，优化的提取方法操作简单，稳定可靠，适用于不同柿属植物叶绿体DNA的提取。

DNA提取过程中发现，君迁子、浙江柿提取效果较油柿、金枣柿要好，深入分析发现4种柿属植物叶片形态特征具有很大差异，其中油柿叶片柔软，表面密被绒毛；而金枣柿叶片质地脆硬，表面光滑、有金属光泽，且叶脉明显主脉基部有腺体；君迁子、浙江柿叶片形态特征较为相似，叶片纸质柔软，表面绒毛少，不同的叶片结构，特别是质地与绒毛多少，可能对提取效果有一定影响。此外，根据已有报道，4种植物叶片中次级代谢产物含量存在较大差异，金枣柿叶片中维生素C等次级代谢物含量较高[18]，这可能影响了DNA提取得率，具体影响因素还需进一步的试验加以验证。

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Optimization of method for extracting chloroplast DNA inDiospyros

FU Jian-min1, LIANG Yu-qin1, SUNn Peng1, JI Yan-xiao2, TAN Xiao-feng3
(1.Non-timber Forestry Research & Development Center, Chinese Academy of Forestry, Zhengzhou 450003, Henan, China;2.College of Life Science of Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China; 3.Key Lab of Non-wood Forest Products of Forestry Ministry, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

In order to optimize the method of extracting chloroplast DNA（cpDNA）fromDiospyros lotusL.,D. oleiferaCheng,D.glaucifoliaMetc. andD. kakispp., the technology of Percoll density-gradient centrifugation was used. The results show that the cpDNA ofDiospyroscould be quickly, simply, repeatedly and steadily extracted by the method. The quality of the cpDNA which was isolated by this method was determined through the technology of agarose gel electrophoresis, which indicated that the purity, concentration and quality of cpDNA was good enough for further PCR ampli fi cation and genomic sequencing analysis.

Diospyros; chloroplast; cpDNA extraction; Percoll density-gradient centrifugation

S718.46；S665.2 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2015)12-0025-04

2014-08-08

国家“十二五”科技计划课题“涩柿种质资源收集评价与新品种选育”（2013BAD14B0502）

傅建敏，副研究员

谭晓风，教授；E-mail：tanxiaofengcn@126.com

傅建敏， 梁玉琴，孙 鹏，等. 柿属植物叶绿体DNA提取方法优化[J].中南林业科技大学学报, 2015, 35(12): 25-28, 33.

[本文编校：文凤鸣]